L’USO DI UN SISTEMA 3D DI EPITELIO INTESTINALE UMANO PER STUDIARE IL RUOLO DEI TRASPORTATORI NELL’ASSORBIMENTO INTESTINALE DELLE MICROCISTINE

Le microcistine (MCs) sono un gruppo di circa 200 eptapeptidi, prodotti secondari del metabolismo dei cianobatteri le cui fioriture nei corpi idrici stanno aumentando in frequenza ed estensione a causa di eutrofizzazione, attività antropiche e cambiamenti climatici. L’esposizione orale è la più frequente per ingestione di cibo (es prodotti ittici), acqua potabile ed integratori alimentari (BGAS) contaminati. L’organo bersaglio principale è il fegato, e la tossicità è congenere-specifica. Poiché le varianti sono equipotenti nell’inibizione delle fosfatasi 1 e 2A (evento molecolare iniziale), tali differenze sono state attribuite a una diversa cinetica. Le MCs sono detossificate attraverso coniugazione con il GSH, reazione sia spontanea che catalizzata delle Glutatione-S-trasferasi. L’uptake negli epatociti di queste tossine è mediato dai trasportatori OATP; anche l’assorbimento gastrointestinale è dovuto a trasporto attivo, ma ad oggi non sono disponibili studi specifici sul sistema di trasporto intestinale che comprende proteine di influsso ed estrusione. Nel presente lavoro abbiamo studiato l’assorbimento di cinque MCs (MC-LR, RR, YR, LW e LF), utilizzando un sistema in vitro 3D di epitelio intestinale umano (EpiIntestinalTM), costituito da vari tipi cellulari, differenziato e polarizzato, che riproduce sia l’anatomia (lume intestinale/ comparto basolaterale per il flusso sanguigno) che le funzionalità intestinali. Mediante il calcolo della velocità di trasporto espressa in termini di coefficiente di permeabilità Papp, si è misurata la capacità di queste tossine di attraversare l’epitelio intestinale. Papp= (dQ/dt)/C0*A, dove dQ/dt è il flusso (quantità di sostanza/ unità di tempo), C0 è la concentrazione iniziale e A è l’area dell’epitelio. L’uso di un sistema substrato/inibitore specifico ha confermato la presenza di trasportatori di efflusso (PgP, MRP2 e BCRP) e di assorbimento (OATP 2B1 e 1A2), ulteriormente supportata da un’analisi western blotting del tessuto e ha permesso di identificare il coinvolgimento relativo nel trasporto delle MCs. La quantificazione dei vari substrati, delle MCs e del coniugato nei vari comparti è stata fatta mediante metodi HPLC ad hoc. Non è mai stata evidenziata la presenza del coniugato indicando una bassa capacità metabolica del sistema o la sua degradazione successiva. I risultati hanno mostrano la partecipazione sia di trasportatori di efflusso che di assorbimento delle varie MCs (40 μM) che portano a valori netti di Papp simili (meno di 4 x 10-7 cm2/sec). L’assorbimento della MCLW sembra legato solo all’OATP 2B1, la forma principalmente espressa nell’intestino. I dati di uptake congenere-specifico ottenuti solo rispetto all’attività degli OATP, dovrebbero essere rivisti alla luce di un'azione combinata con le proteine di efflusso.