Profilo di espressione dei microRNA tumorali e circolanti in pazienti affetti da Medulloblastoma

Lo studio condotto nel corso del Dottorato di Ricerca (29° ciclo) svolto nel triennio 2013-2016 ha riguardato l’individuazione e la validazione di microRNA in un tumore cerebrale maligno pediatrico, il medulloblastoma (MB). SCOPO: Obiettivo principale dello studio è stato quello di identificare uno (o più) microRNA specifico/i della patologia. A questo scopo è stata valutata l’espressione dei microRNA nei campioni tumorali ed anche nei campioni di plasma dei pazienti, ossia sono stati valutati i cosidetti microRNA circolanti. In particolare sono stati inclusi nello studio campioni tumorali e di plasma appartenenti a pazienti affetti da medulloblastoma di un solo gruppo molecolare, il gruppo molecolare 4 (G4) che è il sottogruppo tumorale più frequente ed anche il meno caratterizzato da un punto di vista patogenetico per il quale non era disponibile un biomarcatore di malattia. METODI: I microRNA sono stati valutati da campioni di RNA totale, estratto sia da tessuto sia da plasma, mediante tecniche di Next Generation Sequencing (Small-RNA sequencing). I livelli di espressione dei microRNA di interesse, ossia risultati deregolati in pazienti affetti ed anche dosati in circolo, sono stati validati mediante qPCR. RISULTATI: Il primo screening NGS è stato eseguito in 4 campioni di RNA totale estratto da tessuto tumorale (MB1-4) e da 4 tessuti di cervelletto normale, normal cerebellum (NC1-4). Tale fase dello studio ha permesso di identificare un profilo di 152 microRNA differenzialmente espressi nel confronto tra campioni tumorali versus campioni di tessuto sano. Un secondo screening NGS è stato eseguito in campioni di RNA estratti dal plasma degli stessi 4 pazienti MB1-4 e dal plasma di 4 donatori sani di stessa età e sesso (C1-4). Tale fase dello studio ha permesso di identificare un profilo di 44 microRNA circolanti in pazienti affetti da MB G4. Dei 44 microRNA dosati nel plasma dei pazienti MB G4, 21 sono risultati essere microRNAs inclusi nei microRNAs MB G4 specifici appartenenti al profilo di espressione tumorale ossia ai 152 microRNA. A questo punto dello studio erano stati identificati 152 microRNA tumore specifici ed anche 21 microRNA circolanti (di questi 152) dosabili in pazienti affetti dagli stessi tumori. Tali 21 microRNA sono stati ipotizzati essere biomarcatori tumorali e biomarcatori circolanti di MB G4. Allo scopo di validare l’ipotesi del ruolo di biomarcatori dei 21 microRNA, gli stessi sono stati successivamente valutati anche tramite QPCR in una coorte più ampia di pazienti costituita da altri 6 MB G4. Pertanto la valutazione finale dei 21 microRNAs è stata eseguita in 10 pazienti (MB1-10) e 5 controlli (C1-5). Questo studio in QPCR ha permesso di confermare che i 21 microRNA individuati erano biomarcatori tumorali in circolo. Infine, per alcuni microRNA dei 21 individuati, ed in particolare i microRNA appartenti a due cluster oncogenici, miR-17/92 e miR-106b/25, già descritti nel Medulloblastoma, è stata valutata l’espressione in circolo sia in corso di malattia (prima dell’intervento chirurgico, PRE) ed anche dopo intervento chirurgico, ossia in pazienti non affetti da residuo di malattia o recidiva. Tale valutazione è stata definita POST ed è stata eseguita a 6 mesi dall’intervento. I risultati di questa fase dello studio hanno permesso di verificare che i livelli di espressione dei microRNA circolanti, risultati alti in pazienti affetti da MB G4 (PRE), si riducono in pazienti curati (POST). In conclusione lo studio condotto ha permesso di identificare un profilo di microRNA più espressi non solo nei tumori dei pazienti affetti da MB G4 ma anche dosabili in circolo e pertanto con potenziale ruolo come biomarcatori di malattia da utilizzare alla diagnosi ed anche nel corso del follow-up.