Invecchiamento ovocitario umano: parametri strutturali ed ultrastrutturali

XXVI Ciclo di Dottorato in “Biotecnologie della Riproduzione Umana” – Università “Sapienza” di Roma. Riassunto 3° anno (anno accademico 2012/2013) Dottoranda: Claudia Boninsegna Titolo del progetto di ricerca: “Invecchiamento ovocitario umano: parametri strutturali ed ultrastrutturali” L’infertilità è definita come l’incapacità di una coppia di concepire dopo un anno o più di rapporti sessuali regolari non protetti. Negli ultimi decenni si è riscontrato un notevole aumento dei tassi di infertilità, dovuto principalmente al ritardo nella programmazione della gravidanza. L’esistenza di una relazione inversa tra età e fertilità femminile è nota da tempo ed è determinata dalla graduale diminuzione che si verifica con l’età sia nella quantità che nella qualità dei gameti femminili, gli ovociti. Lo scopo di questo lavoro è l’osservazione approfondita, tramite microscopia ottica e microscopia elettronica a trasmissione, dei tratti morfologici che caratterizzando l’invecchiamento ovocitario, sia nel processo fisiologico dell’invecchiamento riproduttivo (reproductive aging, RA), sia nel corso dell’invecchiamento in vitro (in vitro aging, IvA). Lo studio è stato condotto su 61 ovociti maturi (MII) soprannumerari donati alla ricerca, previa firma di un consenso informato e secondo le leggi vigenti, da 23 pazienti che si sono sottoposte a trattamenti di fecondazione assistita (IVF o ICSI) nel periodo compreso tra Ottobre 2007 e Luglio 2013. I trattamenti sono stati eseguiti presso la UOC OGC03 - Infertilità e FIVET (Prof. C. Aragona) del DAI (Dipartimento di Attività Integrata) di Ginecologia e Ostetricia, Perinatologia e Puericultura (Prof Pierluigi Benedetti Panici) dell’Azienda Policlinico Umberto I, Università “Sapienza” di Roma (DU -Dipartimento Universitario- di Scienze Ginecologico-ostetriche e Scienze Urologiche, Prof Vincenzo Gentile) Gli ovociti sono stati suddivisi in due gruppi in base all’età delle pazienti: A (età inferiore a 35 anni, 25 ovociti) e B (età uguale o superiore ai 35 anni, 36 ovociti). Un totale di 31 ovociti (13 ovociti nel gruppo A e 18 del gruppo B) sono stati fissati poco dopo il pick up (tempo 0); i rimanenti 30 (12 nel gruppo A e 18 del gruppo B) sono stati fissati dopo 24 ore di coltura. La successiva analisi di microscopia ottica ed elettronica è stata condotta presso la UO Microscopia elettronica (Prof. Giuseppe Familiari), sezione di Anatomia Umana (Prof. E. Gaudio) del Dipartimento di Scienze Anatomiche, Istologiche, Medico Legali e dell’Apparato Locomotore (Prof. Elio Ziparo) dell’Università “Sapienza” di Roma. Tale analisi è stata condotta in collaborazione con la sezione di Anatomia (Prof. Guido Macchiarelli) del Dipartimento di Scienze della Salute dell’Università degli studi dell’Aquila. I gruppi in esame erano perciò i seguenti: • gruppo <35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età inferiore a 35 anni • gruppo <35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età inferiore a 35 anni • gruppo ≥35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età uguale o superiore a 35 anni • gruppo ≥35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età uguale o superiore a 35 anni Per la valutazione della preservazione strutturale (microscopia ottica) e ultrastrutturale (microscopia elettronica a trasmissione) degli ovociti sono stati presi in considerazione diversi parametri morfologici; l’analisi statistica si è concentrata su 5 di essi - spessore della zona pellucida (zona pellucida thickness, ZPt) - numero di granuli corticali (cortical granules, CG) per 10 um di superficie lineare - numero di microvilli (Mv) per 10 um di superficie lineare - densità degli aggregati di mitocondri e tubuli di reticolo endoplasmatico liscio (mitochondria-smooth endoplasmic reticulum aggregates, M-SER) per 10 um2 di area citoplasmatica - densità dei complessi di mitocondri e vescicole di reticolo endoplasmatico liscio (mitochondria-vesicle complex, MVC) per 10 um2 di area citoplasmatica Gli ovociti del gruppo <35 mostrano le caratteristiche ultrastrutturali tipiche degli ovociti MII ideali: MVC piccole e scarsamente rappresentate (densità 0,35±0,26 per 10um2) ed aggregati M-SER ben rappresentati (densità 2,89±0,68 per 10um2), una quantità adeguata di CGs e di Mv (rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 18,32±1,93um. Negli ovociti del gruppo <35c si osserva un aumento della densità di MVC (1,31±0,36 per 10um2) ed una contemporanea riduzione dei complessi M-SER (1,80±0,35 per 10um2) e, in misura più lieve, dei CG e dei Mv (rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 18,27±1,74um. Neli ovociti del gruppo ≥35 i MCV sono presenti in numero maggiore (densità 2,05±0,48 per 10um2), i complessi M-SER sono scarsi (0,97±0,28 per 10um2) e si osserva una ulteriore riduzione dei CG e dei Mv (rispettivamente 7,45±1,37 e 6±1 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 21,73±1,79um. Negli ovociti del gruppo ≥35c si osserva un aumento notevole della densità dei MVC (3,19±0,40 per 10um2) e una marcata diminuzione dei complessi M-SER (0,57±0,31 per 10um2). Si osserva anche una riduzione della quantità di CG e di Mv (rispettivamente 2,55±1,37 e 4,73±1,13). Lo spessore medio della ZP era 21,55±1,57um. Rispetto agli ovociti di “controllo”, appartenenti al primo gruppo (<35), le variazioni numeriche mostrano dunque un andamento graduale, essendo minime nel gruppo <35c, più evidenti nel gruppo ≥35 e molto accentuate nel gruppo ≥35c. In conclusione, gli ovociti invecchiati in vitro e quelli invecchiati in vivo condividono molte caratteristiche ultrastrutturali tipiche che possono essere considerate markers morfologici di invecchiamento. Inoltre i dati presentati in questo lavoro rivelano che gli ovociti di donne giovani sembrano meno sensibili all’invecchiamento in vitro rispetto a quelli di donne in età avanzata, già soggetti a invecchiamento riproduttivo. Questi ultimi ovociti sembrano subire un invecchiamento in vitro prematuro, che potrebbe spiegare la loro ridotta finestra di fecondazione e la minore competenza di sviluppo.