Interazione in cis di notch3 e jagged1: identificazione di un nuovo meccanismo molecolare coinvolto nella progressione della leucemia linfoblastica acuta a cellule T

La via di segnalazione dei recettori di membrana appartenenti alla famiglia Notch è estremamente conservata dagli Invertebrati ai Vertebrati e regola numerosi eventi quali proliferazione, sopravvivenza, differenziamento e morte cellulare (Artavanis-Tsakonas 1999; Bray S.J., 2006; Miele I., 2006). Il modello classico di attivazione della via di segnalazione di Notch prevede il legame tra i recettori Notch, espressi sulle cellule riceventi il segnale, e i loro specifici ligandi DSL espressi sulla superficie delle cellule segnalanti adiacenti. La specifica interazione recettore/ligando determina cambiamenti conformazionali nella struttura delle proteine Notch, che le rendono suscettibili ad un processamento proteolitico mediato prima dalla famiglia delle metalloproteasi ADAM e successivamente dal complesso delle PS/γ-secretasi (Kopan R., 1998; Brou C., 2000; Jarriault S., 1995). Tali eventi sono necessari per attivare il recettore Notch, espresso nella cellula ricevente, e liberare un frammento intracitoplasmatico solubile Notch-IC, in grado di traslocare nel nucleo e di influenzare la regolazione trascrizionale di numerosi geni bersaglio tra cui i membri della famiglia hairy and enhancer of split (Hes) e pTα (Bellavia D. 2000). Le proteine transmembrana DSL (Delta1-3-4, Jagged1-2) sono state identificate come i principali ligandi dei recettori Notch espressi sulle cellule adiacenti. Solo di recente è stato dimostrato che similmente ai recettori Notch anche il ligando Jagged1 è un substrato dell’azione proteolitica mediata dalla metalloproteasi ADAM17/TACE. Il risultato di questo taglio proteolitico è il rilascio di un frammento extracellulare solubile (shedding) e la formazione di un frammento ancorato alla membrana (Jag1 TMIC), corrispondente al dominio C-terminale. Il frammento Jag1 TMIC è oggetto di un secondo taglio proteolitico mediato dal complesso delle PS/γ-secretasi, liberando così un frammento solubile intracitoplasmatico Jag1ICD, in grado di traslocare nel nucleo (LaVoie M.J. 2003). Recentemente è stata ipotizzata l’esistenza di una via di segnalazione bidirezionale che coinvolge non solo la cellula esprimente il recettore, ma anche la cellula esprimente il ligando. Dati di letteratura suggeriscono, infatti, che Jagged1 è in grado di innescare una via di segnalazione intrinseca per mezzo del suo dominio solubile intracellulare Jag1ICD, liberato successivamente all’azione del complesso delle PS/γ-secretasi, che è in grado di controllare l’espressione trascrizionale di Notch3 e dello stesso ligando, in cellule over-esprimenti Jagged1. Inoltre, è stato suggerito che la presenza costitutiva del dominio intracitoplasmatico di Jagged1, contenente un dominio PDZ-ligand, è fortemente associata a processi di trasformazione neoplastica in cellule esprimenti il ligando Jagged1 (Ascano J.M. 2003). Recentemente evidenze sperimentali dimostrano che l’alterata espressione dei ligandi DSL, in particolar modo Jagged1 e Delta1, correla strettamente con la comparsa di tumori solidi. In particolare, è stato mostrato che un’ espressione deregolata del ligando Jagged1, nonché la specifica interazione Jagged1/Notch è strettamente associata con l’insorgenza di tumori solidi dell’ovaio (Jung-Hye Choi et al., 2008) e del colon (Gao J., 2010). Nel nostro laboratorio, è stato precedentemente osservato che l’attivazione costitutiva del “signaling” di Notch3 determina l’insorgenza di una forma di leucemia linfoblastica acuta a cellule T (T-ALL) mediante la realizzazione del modello animale transgenico lck-Notch3-IC. La leucemia a cellule T che si sviluppa nel topo Notch3-IC transgenico ricorda come decorso clinico la leucemia T-ALL umana, caratteristica dell’età pediatrica (Bellavia D., 2000). Inoltre, è stato dimostrato che la forzata attivazione della via di segnalazione del recettore Notch3 determina una persistente espressione della catena invariante pTα del preTCR, sia nei timociti sia nelle cellule T periferiche, infatti, la mancata regolazione del gene pTα sembra essere direttamente coinvolta nell’insorgenza della leucemia T-ALL indotta da Notch3. A questo proposito, la realizzazione di topi doppi mutanti Notch3IC TG/ pTα -/- ha permesso di dimostrare che la combinata espressione di Notch3 e pTα è necessaria per l’insorgenza della T-ALL (Bellavia D., 2002). In questa tesi si dimostra che esiste una specifica ed unica relazione tra il recettore Notch3 e il suo specifico ligando Jagged1 nella progressione della leucemia linfoblastica acuta a cellula T, caratterizzata da un’attivazione persistente del dominio intracellulare di Notch3-IC. Abbiamo osservato, infatti, sia in vitro che in vivo, che cellule T linfomatose caratterizzate dall’attivazione costitutiva di Notch3-IC co-esprimono all’interno della stessa cellula oltre al recettore Notch3 full- lenght anche il ligando specifico Jagged1 (cis-espressione). Tale cis-espressione è il risultato della forzata attivazione del signalling di Notch3, che per la prima volta in questa tesi è stato dimostrato essere in grado di attivare direttamente il promotore del ligando Jagged1 e regolarne la sua trascrizione. Inoltre, è stata dimostrata, in cellule di leucemia/linfoma a cellule T rappresentate da una linea cellulare immortalizzata derivante dai timociti di topo trasgenico Notch3-IC, N3-232T, l’esistenza di un costitutivo processamento del ligando Jagged1, identificabile nei frammenti rilasciati a valle dei tagli proteolitici mediati dalla metalloproteasi ADAM17/TACE e dal complesso delle PS/γ-secretasi: Jagged1 ECD e Jagged1ICD. E’ interessante notare che per la prima volta è stato osservato che tali eventi che sostengono il processamento di Jagged1 sono dipendenti dalla presenza di microdomini lipidici di membrana (raft). In aggiunta, l’osservazione dell’espressione contestuale di ligando e recettore all’interno delle stesse cellule e della loro costitutiva attivazione ci ha indotti ad ipotizzare e dimostrare l’esistenza di un’interazione specifica tra Notch3 e Jagged1 “in cis”. Si è quindi definito il ruolo funzionale di questa cis-interazione ed è stato identificato il meccanismo molecolare in grado di sostenere una più rapida progressione del processo di leuchemogenesi indotto da Notch3. In questa tesi abbiamo messo in evidenza che l’espressione del ligando Jagged1 in cis con il recettore Notch3 svolge un ruolo significativo nel potenziare la via di trasduzione indotta in maniera specifica da Notch3, poiché da un lato è in grado di sostenere e aumentare l’attivazione di specifici bersagli di Notch3, quali pTα, prendendo parte al complesso trascrizionale composto da RBP-Jk, MAML1 e Notch3-IC, e dall’altro lato è in grado di potenziare l’attivazione trascrizionale dello stesso ligando Jagged1. Inoltre, in questa tesi si dimostra in vivo che il frammento solubile Jagged1ECD, risultante dal clivaggio costitutivo del ligando, è in grado di determinare l’attivazione della via di segnalazione del recettore Notch3 espresso sulle cellule adiacenti (effetto paracrino). L’insieme di questi dati supporta l’esistenza di un loop autocrino e pacrino associato al ligando Jagged1 in grado di interferire con la via di segnalazione del recettore Notch3 e di determinare la progressione della leucemia linfoblastica acuta a cellule T indotta da Notch3.