Basi molecolari del medulloblastoma: ruolo delle E3-ligasi REN ed ITCH nel signaling di Hedgehog

Il medulloblastoma è la forma più comune di neoplasia infantile. È causato da alterazioni genetiche e epigenetiche che influenzano lo sviluppo delle cellule progenitrici dei granuli del cervelletto. Tali difetti comprendono delezioni cromosomiali, come la delezione del braccio corto del cromosoma 17, ed alterazioni nelle più importanti vie di trasduzione del segnale. È stato recentemente descritto che il medulloblastoma è strettamente legato all’attivazione costitutiva della pathway Sonic-Hedgehog-Gli. Sebbene il ruolo del segnale di Hedgehog (Hh) nei processi di embriogenesi e tumorigenesi sia ben noto, i meccanismi molecolari che ne sottendono la regolazione sono ancora ad oggi non definiti. Dati di letteratura riportano che processi proteolitici ubiquitina-dipendente rappresentano un evento cruciale per il controllo della via di Hh. Nel nostro laboratorio sono stati identificati due nuovi meccanismi di degradazione ubiquitina-dipendente coinvolti nella regolazione della proteina Gli1, il principale effettore del signaling di Hh: i) un meccanismo di degradazione promosso dalla proteina “adaptor” Numb e mediato dalla E3-ligasi Itch, appartenente alla famiglia delle HECT-E3 ubiquitin ligasi; ii) un meccanismo di degradazione indotto da una nuova E3-ligasi, REN/Cul3, da noi identificata, appartenente alla famiglia delle RING E3-ligasi. Dati precedentemente pubblicati dal nostro gruppo avevano dimostrato che una riduzione dei livelli di ubiquitinazione di Gli1, con conseguente accumulo, avvengono nel medulloblastoma a causa della perdita di Numb, una proteina coinvolta nella determinazione del destino cellulare, nel self-renewal e nel differenziamento (Di Marcotullio et al., 2006; Gulino et al., 2010). Inoltre era stato dimostrato come l’ubiquitinazione e la degradazione di Gli1 indotta da Numb fosse mediata dall’E3 ligasi Itch (Di Marcotullio et al., 2006). Sebbene, il ruolo dell’asse Gli/Numb/Itch nello sviluppo del medulloblastoma fosse stato ben sviluppato, i meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione dell’attività di queste proteine non erano stati chiariti. Nella prima parte del mio lavoro di tesi ci siamo occupati di approfondire i meccanismi alla base dell’interazione tra Numb, Itch e Gli1 e di evidenziarne il significato funzionale. Numb interagisce con la regione centrale di Itch, contenente i domini WW, in particolare con il secondo dominio WW (WW2). Domini WW sono comunemente utilizzati per il legame con i diversi substrati di Itch, ed infatti abbiamo anche scoperto che Gli1 interagisce con la medesima regione. Tramite esperimenti di legame, sia in vivo che in vitro, abbiamo dimostrato che Numb ha la funzione sia di attivare Itch che di reclutare Gli1. Itch si trova infatti in una conformazione inattiva auto-inibitoria, in cui il ripiegamento del dominio catalitico HECT (C-terminale) in corrispondenza della regione dei WW (N-terminale), ne inibisce la sua attività catalitica. Il legame di Numb destabilizza l’interazione HECT-WW promuovendo l’apertura della struttura e portando quindi ad una conformazione attiva. Ciò favorisce l’entrata di Gli1 nel complesso e la sua successiva ubiquitinazione. A tal proposito, abbiamo dimostrato che Itch è in grado di legare direttamente Gli1 e che tale legame avviene tra i domini WW di Itch e i WW-binding sites PPXY e la S1060P, presenti nella regione C-terminale di Gli1. Importante, la proteina Gli1 mutata in questi siti non è soggetta alla proteolisi indotta da Itch e presenta maggiori proprietà oncogeniche. La seconda parte del lavoro di tesi è stata finalizzata all’analisi dei meccanismi molecolari che regolano l’attività di RENKCTD11/Cul3 ed alla loro alterazione nel medulloblastoma. In un lavoro precedentemente pubblicato, avevamo identificato RENKCTD11 come un oncosoppressore, localizzato sul cromosoma 17p e capace di antagonizzare l’attività di Hh. Sebbene fosse stata dimostrata la capacità di RENKCTD11 di inibire la funzione trascrizionale di Gli1, i meccanismi responsabili di questo processo non erano stati chiariti. Il fatto che REN possiede un dominio BTB/POZ (coinvolto nell’interazione con la Cullina3), responsabile del suo effetto sulla crescita e differenziamento dei progenitori neuronali e che uno dei meccanismi di ubiquitinazione di Gli1, vede il coinvolgimento del complesso HIB-SPOP/Cul3, ci ha fatto ipotizzare che RENKCTD11 fosse in grado di interagire con Cul3 e regolare la stabilità di proteine del signaling di Hh. Tramite esperimenti di co-IP e saggi di ubiquitinazione in vitro ed in vivo, abbiamo mostrato che RENKCTD11, attraverso un legame diretto con il dominio BTB/POZ, forma un complesso con Cul3 e svolge azione ubiquitin-ligasica. In particolare, abbiamo dimostrato che RENKCTD11 è capace di indurre ubiquitinazione e degradazione di HDAC1, una deacetilasi recentemente identificata nel nostro laboratorio come un potente attivatore del signaling di Hh e altamente espressa nei medulloblastomi. L’espressione ectopica di RENKCTD11, in linee cellulari di medulloblastoma, determinava una riduzione dei livelli di HDAC1, portando ad inibizione dell’attività di Gli1 e ad arresto della proliferazione. I risultati ottenuti da questa ricerca svelano la funzione di RENKCTD11 come una nuova Cul3-E3 ligasi ed il meccanismo attraverso il quale RENKCTD11, regolando negativamente HDAC1, inibisce il signaling di Hh. Queste evidenze sperimentali identificano nuovi meccanismi di regolazione dell’attività di Gli1 e forniscono una solida ragione per indagare sull'ipotesi che le proteine, Numb, Itch e RENKCTD11, sono coinvolte nello sviluppo del medulloblastoma e possono rappresentare bersagli per nuove strategie terapeutiche.