Introduzione Le cellule Natural Killer (NK) rappresentano una sottopopolazione di linfociti dell’immunita’ innata che svolgono un ruolo importante nel processo di immunosorveglianza dei tumori incluso il mieloma multiplo (MM), una neoplasia sostenuta dall’espansione clonale di plasmacellule maligne nel midollo osseo. Le cellule tumorali possono modulare le funzioni del sistema immunitario attraverso la secrezione sia di fattori solubili che di vescicole come gli esosomi. Tali microvescicole, formate nel compartimento endosomiale rappresentano un importante meccanismo di comunicazione tra cellule data la loro capacità di trasportare proteine, lipidi ed acidi nucleici. Scopo del progetto Scopo del mio progetto di dottorato e’stato quello di isolare e caratterizzare gli esosomi prodotti da cellule di MM sia in condizioni basali che in seguito a trattamento con il Melphalan, un agente genotossico utilizzato nella terapia del MM e di studiarne l’effetto sulle funzioni mediate dalle cellule NK. Risultati Il trattamento con il Melphalan determina un significativo aumento del rilascio di esosomi da parte di cellule di MM. La caratterizzazione srutturale e molecolare degli esosomi, effettuata utilizzando la microscopia elettronica, il western blot, e l’immunofluorescenza ed analisi al citofluorimetro mostra che queste vescicole esprimono molecole di derivazione endosomiale tra cui il CD63, il Tsg101, le molecole MHC di classe I, l’Hsp70 ed e’ importante notare l’assenza di calreticulina, una proteina esclusivamente presente nel reticolo endoplasmatico. Mediante analisi del profilo di espressione dei microRNA contenuti negli esosomi, ne abbiamo individuati alcuni potenzialmente in grado di modulare le funzioni delle cellule NK. Avvalendoci dell’analisi al microscopio confocale e al citofluorimetro, abbiamo osservato che gli esosomi sono captati e internalizzati da cellule NK e sono in grado d’indurre l’espressione del marcatore di attivazione CD69, di stimolare la produzione di INF-γ e di potenziare la proliferazione delle cellule NK indotta dall’IL-15. Il pre-trattamento delle cellule NK con l’SN50, un peptide che impedisce la traslocazione di NF-kB nel nucleo, determina l’inibizione della produzione di INF-γ indotta dagli esosomi suggerendo un coinvolgimento del “pathway” di NF-kB. Per individuare il meccanismo mediante cui gli esosomi attivano le cellule NK, ci siamo avvalsi dell’uso di cellule transfettate stabilmente con diversi recettori della famiglia toll (TLR) insieme al reporter luciferasi sotto il controllo di NF-kB. I nostri risultati dimostrano che gli esosomi inducono selettivamente l’attivita’ della luciferasi in cellule reporter esprimenti il recettore TLR2. Conclusioni I nostri risultati indicano che l’agente chemioterapico melphalan aumenta il rilascio degli esosomi da cellule di MM e che queste microvescicole hanno un ruolo immunostimulatorio sulle cellule NK. Abbiamo infine identificato il TLR2 come possibile “sensore” esosomiale. Questi risultati potrebbero essere importanti per migliorare l’efficacia dei protocolli di immunochemioterapia utilizzando gli esosomi per il potenziamento della risposta immunitaria innata.

Molecular characterization and immunomodulatory properties of MM cell-derived exosomes on NK cell-mediated functions: role of Toll-like receptor 2 / Vulpis, Elisabetta. - ELETTRONICO. - (2016 Feb 05).

Molecular characterization and immunomodulatory properties of MM cell-derived exosomes on NK cell-mediated functions: role of Toll-like receptor 2

VULPIS, ELISABETTA
05/02/2016

Abstract

Introduzione Le cellule Natural Killer (NK) rappresentano una sottopopolazione di linfociti dell’immunita’ innata che svolgono un ruolo importante nel processo di immunosorveglianza dei tumori incluso il mieloma multiplo (MM), una neoplasia sostenuta dall’espansione clonale di plasmacellule maligne nel midollo osseo. Le cellule tumorali possono modulare le funzioni del sistema immunitario attraverso la secrezione sia di fattori solubili che di vescicole come gli esosomi. Tali microvescicole, formate nel compartimento endosomiale rappresentano un importante meccanismo di comunicazione tra cellule data la loro capacità di trasportare proteine, lipidi ed acidi nucleici. Scopo del progetto Scopo del mio progetto di dottorato e’stato quello di isolare e caratterizzare gli esosomi prodotti da cellule di MM sia in condizioni basali che in seguito a trattamento con il Melphalan, un agente genotossico utilizzato nella terapia del MM e di studiarne l’effetto sulle funzioni mediate dalle cellule NK. Risultati Il trattamento con il Melphalan determina un significativo aumento del rilascio di esosomi da parte di cellule di MM. La caratterizzazione srutturale e molecolare degli esosomi, effettuata utilizzando la microscopia elettronica, il western blot, e l’immunofluorescenza ed analisi al citofluorimetro mostra che queste vescicole esprimono molecole di derivazione endosomiale tra cui il CD63, il Tsg101, le molecole MHC di classe I, l’Hsp70 ed e’ importante notare l’assenza di calreticulina, una proteina esclusivamente presente nel reticolo endoplasmatico. Mediante analisi del profilo di espressione dei microRNA contenuti negli esosomi, ne abbiamo individuati alcuni potenzialmente in grado di modulare le funzioni delle cellule NK. Avvalendoci dell’analisi al microscopio confocale e al citofluorimetro, abbiamo osservato che gli esosomi sono captati e internalizzati da cellule NK e sono in grado d’indurre l’espressione del marcatore di attivazione CD69, di stimolare la produzione di INF-γ e di potenziare la proliferazione delle cellule NK indotta dall’IL-15. Il pre-trattamento delle cellule NK con l’SN50, un peptide che impedisce la traslocazione di NF-kB nel nucleo, determina l’inibizione della produzione di INF-γ indotta dagli esosomi suggerendo un coinvolgimento del “pathway” di NF-kB. Per individuare il meccanismo mediante cui gli esosomi attivano le cellule NK, ci siamo avvalsi dell’uso di cellule transfettate stabilmente con diversi recettori della famiglia toll (TLR) insieme al reporter luciferasi sotto il controllo di NF-kB. I nostri risultati dimostrano che gli esosomi inducono selettivamente l’attivita’ della luciferasi in cellule reporter esprimenti il recettore TLR2. Conclusioni I nostri risultati indicano che l’agente chemioterapico melphalan aumenta il rilascio degli esosomi da cellule di MM e che queste microvescicole hanno un ruolo immunostimulatorio sulle cellule NK. Abbiamo infine identificato il TLR2 come possibile “sensore” esosomiale. Questi risultati potrebbero essere importanti per migliorare l’efficacia dei protocolli di immunochemioterapia utilizzando gli esosomi per il potenziamento della risposta immunitaria innata.
5-feb-2016
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Tesi dottorato Vulpis

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Tipologia: Tesi di dottorato
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11573/894481
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