Effete/UbcD1, a Drosophila ubiquitin conjugating enzyme, involved in genome stability

During my three PhD years, I focused my interest on the study of Eff/UbcD1, a well conserved protein known to be involved in telomere protection in Drosophila. Mutations in the effete/UbcD1 gene, that encodes a highly evolutionarily conserved ubiquitin-conjugating enzyme, lead to frequent Telomeric Fusions (TFs) in Drosophila mitotic cells, indicating that Effete/UbcD1 is required for telomere protection. However, little is known about the molecular mechanism underlying this function. Recent work has shown that Effete/UbcD1 is a chromatin component that on polytene chromosomes strongly co-localizes with Heterochromatin Protein 1 (HP1), a well-known chromatin factor that is also required to prevent TFs. In the first part of my thesis, I describe results on the genetic and molecular relationship between UbcD1 and HP1. Intriguingly, I describe that loss of Eff/UbcD1 in a Hp1 mutant background yields to a frequency of TFs lower than that observed in the single Hp1 mutants, suggesting that protective functions at telomeres of both Eff/UbcD1 and HP1 are strongly interconnected. My biochemical analyses reveal that Eff/UbcD1 physically interacts with and ubiquitinates HP1 and that HP1 itself is able to bind ubiquitin in a non covalent manner. Furthermore, I also demonstrate that Eff/UbcD1 promotes the enrichment of a novel and slow migrating isoform of HP1 (sHP1) that was not described before. Moreover, I describe a previously uncharacterized functional relationship involving HP1, the MRN complex and histone H3. By site-specific mutagenesis, I identified at least 2 different lysines required for HP1 ubiquitination. Of these, Lys151 arises as a key residue for ubiquitination of sHP1 and more importantly, I demonstrate that Lys151 ubiquitination is required for regulating the stability of both MRN complex and histone H3. In the second part of my thesis, I also show results that indicate a role for Eff/UbcD1 in DNA repair. I describe that loss of Eff/UbcD1, but not the Drosophila Rad6 ortholog UbcD6, confers radioresistance after X-ray irradiation. My cytological analysis of mitotic chromosomes reveals that in Eff/UbcD1 mitotic cells the frequencies of chromosome breaks (CBs), chromosome aberrations (CABs) and irradiation induced foci (IRIF) are all significantly reduced after X-ray compared to control. However, the number of X-ray induced CBS and CABs increases when Eff/UbcD1 is overexpressed indicating that Eff/UbcD1 plays a negative role in the DNA damage response (DDR) and/or repair. Moreover, my western blot analysis also indicate that the MRN complex is required for Eff/UbcD1 stability. In addition, Co-IP experiments reveal that Eff/UbcD1 interacts with the MRN complex member Rad50. However, Rad50 protein levels are not affected in eff/UbcD1 mutants, indicating that if Eff/UbcD1 is involved in Rad50 ubiquitination, this modification is not required for Rad50 degradation. Taken together, my results suggest that Eff/UbcD1 plays important roles in the regulation of chromosome stability by interacting with both telomeric and DDR factors.

Durante i miei 3 anni di dottorato, mi sono interessato sullo studio di Eff/UbcD1, una proteina altamente conservata nota per essere coinvolta nella protezione dei telomeri in Drosophila. Mutazioni nel gene eff/UbcD1, che codifica per un enzima E2 evolutivamente conservato, causano un'alta frequenza di fusioni telomeriche (TFs) nelle cellule mitotiche di Drosophila, indicando che Eff/UbcD1 è richiesto per la protezione dei telomeri. Tuttavia si sa molto poco sui meccanismi molecolari alla base di questa funzione. Recenti lavori hanno dimostrato che Eff/UbcD1 è una componente della cromatina che suui cromosomi politenici fortemente colocalizza con HP1, un ben noto fattore cromatino che è anche richiesto per prevenire TFs. Nella prima parte della mia tesi, descriverl i risultati della relazione genetica e molecolare tra UbcD1 e HP1. Descriverò che la perdita di UbcD1 nei mutanti HP1 causa una forte diminuzione delle TFs rispetto al singolo mutante HP1, suggerendo che le funzioni protetttive ai telomeri di entrambe le proteine sono fortemente interconnesse. La mia analisi biochimica rivela che UbcD1 interagisce e ubiquitina HP1 e HP1 è capace di legare l'ubiquitina in maniera non covalente. Inoltre dimostrerò come UbcD1 promuova l'arricchimento di una nuova forma di HP1 che migra lentamente (sHP1) precedentemente non caratterizzata. Inoltre, descriverò una inedita relazione funzionale tra HP1, il complesso MRN e l'istone H3. Attraverso mutagenesi sito specifica, ho identificato almeno 2 diverse lisine richieste per l'ubiquitinazione di HP1. Di queste, la lisina 151, appare essere un residuo chiave per l'ubiquitinazione della forma sHP1 e cosa ancora più importante, dimostrerò che l'ubiquitinazione della lisina 151 è richiesta per regolare la stabilità sia del complesso MRN e dell'istone H3. Nella seconda parte della mia tesi, mostrerò dei risultati che indicano un ruolo di UbcD1 nella riparazione del danno al DNA. Descriverl che la perdita di UbcD1, ma non dell'ortologo di Rad6 di Drosophila, UbcD6, dà radioresistenza dopo irradiamento con raggi X. La mia analisi citologica sui cromosomi mitotici rivela che nelle cellule mitotiche dei mutanti ubcd1 le frequenze di rotture cromosomiche (CBs), aberrazioni cromosomiche (CABs) e i foci indotti da irradiamento (IRIF) sono tutte significativamente ridotte rispetto al controllo. Tuttavia, il numero delle CBs e CABs indotte dai raggi X aumenta a seguito dell'overespressione di UbcD1 indicando che Ubcd1 gioca un ruolo negativo nel riparo al danno al DNA. Inoltre, la mia analisi per western blot indica anche che il complesso MRN è richiesto per la stabilità di ubcd1. In aggiunta, esperimenti di Co-IP rivelano che ubcd1 interagisce con Rad50, un membro del complesso MRN. Tuttavia, i livelli proteici di Rad50 non sono alterati nei mutanti ubcd1, indicando che se ubcd1 è coinvolto nell'ubiquitinazione di rad50, questa modifica non è richiesta per la degradazione di rad50. Presi nel loro insieme, i miei dati suggeriscono che ubcd1 gioca dei ruoli importanti nella regolazione della stabilità cromosomica interagendo sia con fattori telomeri che della risposta al danno al DNA.