Prefrazionamento e arricchimento di proteine sieriche a basso peso molecolare mediante nano HPLC-MS/MS: comparazione di differenti strategie analitiche

Nello studio di una patologia, i biomarcatori possono fornire precise informazioni sul suo sviluppo ed evoluzione, giocando un ruolo fondamentale nella prevenzione, nella diagnosi e nel trattamento della stessa. In particolare i biomarcatori proteici sono degli ottimi indicatori dello stato fisiologico di un organismo e la loro misura può essere usata per valutare i processi normali e/o patologici di un qualsiasi sistema biologico. Un organismo complesso, qual è quello umano, infatti, non può essere compreso esclusivamente tramite lo studio del DNA e dell’mRNA, ma occorre estendere l’analisi alle proteine nel loro insieme (proteoma) perché meglio caratterizzano lo stato fisiologico di un sistema biologico [1]. Quando si indagano i biomarcatori nei fluidi biologici, il sangue con i suoi derivati (siero e plasma) rappresenta la matrice d’elezione in quanto facilmente reperibile con contenuta invasività e in quantità sufficiente per indagini successive e ripetute sullo stesso campione. Inoltre, il sangue riflette lo stato fisiologico e patologico di un organismo dal momento che in esso è possibile trovare cellule tumorali, acidi nucleici, proteine, peptidi e vari metaboliti, secreti da ogni tipologia di tessuti. Lo studio delle proteine plasmatiche come possibili biomarcatori presenta, tuttavia, delle difficoltà dovute al loro elevato numero (circa 4000) e all’ampio range di concentrazione [2,3], di lunga superiore a quello che può essere misurato da uno spettrometro di massa anche se di ultima generazione. Da qui la necessità e l’esigenza di sviluppare sistemi di prefazionamento e arricchimento selettivo di quelle proteine presenti in basse concentrazione (103 pg mL-1). Le strategie utilizzate per far fronte a questi problemi sono numerose [4,5,6], ma nessuna si può ritenere pienamente risolutiva. In questo lavoro sono state comparate tre differenti e innovative strategie per l’arricchimento selettivo delle proteine sieriche presenti a basse concentrazioni. In particolare sono stati indagati i seguenti sistemi: nanoparticelle di idrogel, Proteominer® (peptide ligand affinity beads) e conetti a taglio molecolare Sartorious Vivaspin®. La valutazione di questi tre sistemi, in termini di numero di proteine a basso peso molecolare (≤ 40 kDa) e bassa concentrazione, è stata effettuata mediante approccio “shotgun proteomics” accoppiando la cromatografia nano-HPLC in fase inversa dei peptidi alla spettrometria di massa ad alta risoluzione condotta con lo spettrometro di massa Orbitrap LTQ-XL. I tre sistemi di arricchimento studiati impiegano principi e tecnologie differenti: le nanoparticelle di idrogel legano le proteine sieriche per affinità e sulla base delle dimensioni molecolari; il sistema Proteominer® funziona come un “equalizzatore” delle proteine sieriche; i conetti Sartorius Vivaspin® agiscono, invece, come setacci molecolari. I risultati ottenuti mostrano che il sistema rappresentato dalle nanoparticelle di idrogel porta all’identificazione di 246 proteine, il sistema Proteominer® di 267 e i conetti Sartorius Vivaspin® di 196 proteine, rispettivamente (Figura 1). Focalizzando l’attenzione alle proteine con un peso molecolare ≤ 40 kDa, appare che il sistema rappresentato dalle nanoparticelle di idrogel lega 116 proteine, contro le 93 del sistema Proteominer® e le 95 dei conetti Sartorius Vivaspin®. Queste differenze riflettono i diversi principi operativi alla base dei tre sistemi. Il sistema Proteominer® è un equalizzatore puro e risulta moderatamente efficiente nell’indagine di proteine con peso molecolare ≤ 20 kDa, con solo 33 proteine identificate in questo range. D’altra parte i conetti Sartorius Vivaspin® e il sistema rappresentato dalle nanoparticelle di idrogel offrono risultati migliori (46 e 61 proteine, rispettivamente). Questi dati concordano con la natura dei due sistemi: i conetti Sartorius Vivaspin® agiscono come setaccio molecolare e come tale risultano più selettivi del sistema Proteominer® per le proteine a basso peso molecolare. Il sistema rappresentato dalle nanoparticelle di idrogel, invece, presenta una doppia natura: da una parte equalizzatore e d’altra setaccio molecolare. Molto probabilmente è per questo motivo che offre i migliori risultati. I risultati ottenuti suggeriscono che il sistema rappresentato dalle nanoparticelle di idrogel appare essere una efficace tecnica di estrazione, pre-concentrazione e arricchimento di proteine seriche a bassa concentrazione e basso peso molecolare, nonché un sistema più veloce ed economico rispetto alle altre due tecnologie di frazionamento.