Studio del comportamento di agenti di contrasto in campi ultracustici per tecniche di ecografia diagnostica

Il presente lavoro di ricerca è stato articolato intorno a temi attinenti l’ingegneria biomedica, riguardando, in particolare, lo studio del comportamento di agenti di contrasto in campi ultracustici per tecniche di ecografia diagnostica. Nell’ambito di tale settore scientifico, un ruolo di fondamentale importanza è svolto dalla diagnostica medica per immagini e in particolare dalle tecniche ecografiche. Queste ultime rappresentano un ottimo compromesso tra la pericolosità per l’organismo e la necessità di ottenere immagini dettagliate delle sue sezioni interne, al fine di poter ricavare importanti informazioni sullo stato di salute del paziente. La modesta invasività dell’ecografia diagnostica, inoltre, contribuisce a rendere tale tecnica uno degli strumenti di indagine più utilizzati in ambito medico, non essendo necessari per il suo svolgimento alcuna forma di sedazione o terapia preparatoria. In generale, per tutte le tecniche ecografiche, la ricostruzione delle immagini dei vari distretti corporei costituenti un sistema biologico è basata sulla rilevazione delle onde ultrasonore riflesse in corrispondenza delle discontinuità tessutali presenti al loro interno. L’ottenimento di immagini ecografiche di notevole qualità, comprese quelle sezioni corporee che a causa della loro anatomia e della loro fisiologia risultano altrimenti di difficile studio, è il risultato non soltanto dell’elevato livello tecnologico raggiunto nella realizzazione degli ecografi, ma anche dello sviluppo di una classe di farmaci in grado di incrementare notevolmente, per un limitato intervallo di tempo, il contrasto dell’immagine ecografica, con conseguente incremento del potere diagnostico di questa tecnica di indagine. Tali farmaci sono noti con il nome di agenti di contrasto per ecografia (o con locuzione inglese Ultrasound Contrast Agents, UCA). In generale, tali sostanze sono costituite da sospensioni liquide contenenti microbolle di gas (ossigeno, anidride carbonica, esafluoruro di zolfo ecc.) aventi diametri compresi tra 2 e 10 μm e rivestite da un guscio di natura organica per il conferimento di maggiore stabilità alla microbolla stessa. Le potenzialità di questi ecoamplificatori vanno oltre la sola applicazione come strumento per aumentare il contrasto delle immagini ecografiche, tanto che si ipotizzano utilizzazioni future molto diverse da quest’ultima, come la veicolazione di farmaci verso organi interni difficilmente raggiungibili, oppure la realizzazione di uno strumento non invasivo per la misurazione e il monitoraggio della temperatura di questi. E proprio la caratterizzazione acustica degli UCA, sia al fine di migliorare la qualità delle immagini ecografiche sia per studiare la possibilità di un loro utilizzo come strumento per una misura non invasiva della temperatura, ha costituito l’argomento del presente lavoro di ricerca. Lo studio è stato sviluppato su due fronti, avendo utilizzato per ciascuno di essi una diversa tecnica d’indagine sperimentale, con l’intento di caratterizzare in maniera esaustiva il ‘sistema bolla’ – ovvero il sistema costituito da un gas, un guscio avente una complessa struttura organica e il liquido che circonda entrambi – studiando il comportamento di ciascuno dei suoi componenti. La prima tecnica utilizzata consiste nell’invio di un impulso ultrasonoro all’agente di contrasto e nella successiva acquisizione del segnale da questo modificato. Tale metodo di misurazione, indicato con il nome di tecnica a impulsi ultrasonori (o con locuzione inglese pulse-echo), è stato realizzato mediante l’apparato sperimentale descritto di seguito. Su una cella in ottone, necessaria per stabilizzare la temperatura della soluzione acquosa contenente l’UCA, sono montati tre trasduttori piezoelettrici che emettono, quando alimentati da un generatore di impulsi elettrici, separatamente impulsi ultrasonori aventi bande contigue, in modo tale da coprire complessivamente uno spettro di frequenze compreso tra 1 e 20 MHz, il quale rappresenta l’intervallo all’interno del quale cade la banda passante degli agenti di contrasto per ultrasuoni e nella quale, quindi, è obbligatorio utilizzarli. I trasduttori usati sono in grado, accoppiati al generatore di impulsi elettrici, sia di trasmettere sia di ricevere le onde ultrasonore. Con tale sistema di misura, per ricavare le caratteristiche acustiche dell’UCA, si eseguono due misurazioni successive: la prima trasmettendo e ricevendo l’ultrasuono senza che alcun mezzo di contrasto sia presente, la seconda con questo inserito in soluzione; eseguendo poi il rapporto tra i segnali elettrici ottenuti nelle due situazioni si ricavano le informazioni necessarie per conoscere quantitativamente l’aumento di contrasto dovuto all’UCA e la banda di frequenze per la quale questo si ottiene. Per uno stesso campione, la ripetizione di tale procedimento di misurazione a diversi istanti temporali permette di studiare le modalità con cui l’efficienza degli agenti di contrasto si modifica in funzione del tempo. La variabile tempo rappresenta, per questa categoria di farmaci, uno dei parametri di maggiore interesse sia in relazione al loro utilizzo clinico, vincolando l’operatore a un’esecuzione dell’esame ecografico più o meno accurata a seconda della rapidità con cui si modifica l’efficienza dell’UCA, sia per quanto riguarda lo studio del loro comportamento in funzione di altri parametri di notevole interesse come la temperatura. Infatti, proprio la dipendenza dalla temperatura delle caratteristiche acustiche dell’agente di contrasto rappresenta l’argomento centrale del lavoro di ricerca, che potrebbe essere sfruttata come proprietà termometrica per la realizzazione di uno strumento di misura non invasivo della temperatura corporea interna. La tecnica a impulsi ultrasonori, inoltre, ha permesso di mettere in rilievo il comportamento non lineare delle soluzioni di microbolle che costituiscono gli agenti di contrasto ecografici, fornendo sia interessanti informazioni relative all’intervallo di frequenze nel quale tale fenomeno si manifesta sia un importante strumento per un successivo approfondimento dell’analisi armonica degli ecoamplificatori. Infatti, nonostante l’indagine ecografica sia ancora condotta sfruttando il comportamento lineare sia dei tessuti biologici sia della propagazione ultrasonora all’interno di essi, attualmente sono proprio le ricerche intorno al tema della non linearità, il cui interesse è nato intorno alla metà degli anni Novanta del secolo scorso, che potrebbero rappresentare un importante passo in avanti nel settore dell’ecografia diagnostica, dando vita a un branca completamente nuova già nota con il nome di Immagine armonica (Harmonic imaging, HI). Con tali tecniche, gli effetti prodotti sulla radiazione ultrasonora dalla risposta non lineare degli ecoamplificatori possono essere usati per incrementare, in misura maggiore rispetto a quanto sia ottenibile con l’acustica lineare, la differenza di ampiezza tra l’eco prodotta dalle microbolle e quella generata dai tessuti, in virtù di una non linearità molto meno marcata mostrata da questi ultimi rispetto alle prime. Pertanto, in questo modo, è possibile ridurre la quantità di farmaco, ottenendo gli stessi risultati relativi al miglioramento delle immagini ecografiche ma con il vantaggio di attenuare drasticamente gli artefatti ecografici dovuti all’oscuramento acustico (acoustic shadowing) degli organi sottostanti quelli attraversati dall’agente di contrasto. Il secondo metodo sperimentale utilizzato per indagare le proprietà degli ecoamplificatori si fonda sul fenomeno fisico conosciuto come Effetto fotoacustico, principalmente applicato nell’analisi spettroscopica. Nella sua formulazione classica, dovuta ad A. Rosencwaig e A. Gersho, questo consiste nell’emissione di un’onda acustica da parte di un campione di gas che assorbe una radiazione proveniente da una sorgente modulata di luce, la quale produce un riscaldamento intermittente locale del gas che a sua volta genera l’onda pressoria. L’applicazione del fenomeno fotoacustico al caso degli agenti contrasto è stata realizzata mediante l’apparato sperimentale illustrato di seguito. Una radiazione laser è modulata a frequenza variabile tra 50 e 4000 Hz, mediante un disco forato rotante, e inviata direttamente all’ecoamplificatore contenuto in un’apposita provetta. Di conseguenza, anche il riscaldamento prodotto sull’UCA risulta modulato, causando una variazione di volume che determina la vibrazione di una membrana sensibile proprio alla frequenza di modulazione selezionata. La membrana sensibile è posta a chiusura di un sottile tubo inserito sulla superficie laterale della provetta, il quale ha lo scopo di amplificare le variazioni di volume indotte sulla soluzione contenuta nella provetta stessa. La vibrazione della membrana è rilevata per mezzo di un vibrometro laser che restituisce la misura della velocità di vibrazione. Le variazioni di temperatura indotte dal laser sulla soluzione dell’agente di contrasto si sovrappongono a un valore costante imposto da un sistema esterno di termostatazione, il quale consente l’esecuzione delle misurazioni a diversi valori di temperatura. Elemento fondamentale di questo apparato sperimentale è rappresentato dalla provetta contenente l’ecoamplificatore, chiamata Cella fotoacustica, per la quale è stato necessario, al fine di poterla utilizzare nello studio del comportamento acustico degli agenti di contrasto, ricavare una caratterizzazione sia teorica sia sperimentale, le quali hanno entrambe costituito un argomento essenziale nel lavoro di ricerca. A tal proposito, infatti, è importante notare che l’intervallo delle frequenze di lavoro è determinato dalla risposta in frequenza della cella fotoacustica (compresa nell’intervallo di frequenze 0-1500 Hz) anziché dalla banda passante degli ecoamplificatori, come accade invece con la tecnica a impulsi ultrasonori. E proprio per questa ragione è stato di fondamentale importanza uno studio preliminare del comportamento della cella che ha condotto, per via sperimentale, alla determinazione del sua banda passante e, attraverso la modellizzazione teorica, al calcolo delle sue frequenze di risonanza, utilizzabili infine come grandezza fisica per la determinazione delle proprietà acustiche dell’agente di contrasto. Quest’ultima si attua studiando le variazioni delle frequenze di risonanza e delle corrispondenti ampiezze di vibrazione sia in funzione della temperatura sia in funzione del tempo. La caratterizzazione della cella fotoacustica ha evidenziato che il suo comportamento è riconducibile a quello di un risuonatore di Helmholtz, al quale si sovrappone quello di un oscillatore armonico causato dalle particolari condizioni di chiusura della struttura, determinando complessivamente la presenza di due modi propri in corrispondenza dei quali è stato valutato il comportamento dell’agente di contrasto. Con questa tecnica sperimentale, inoltre, si sono ricavate importanti informazioni relative alla dipendenza sia dalla temperatura sia dal tempo delle caratteristiche microscopiche chimico-fisiche delle microbolle costituenti gli UCA, che sono alla base delle proprietà macroscopiche che permettono di utilizzare attualmente questi farmaci come ecomplificatori nel campo della diagnostica medica. Va sottolineato, infatti, che un ruolo di fondamentale importanza è svolto dal guscio di rivestimento delle microbolle, per il quale, utilizzando l’effetto fotoacustico, si è ottenuta una stima della sua tensione superficiale confrontando i dati ottenuti sperimentalmente con quelli teorici. In conclusione, i risultati ottenuti dall’attività di ricerca svolta durante il triennio di dottorato hanno condotto a una caratterizzazione esaustiva del comportamento di uno specifico agente di contrasto ecografico (SonoVue®, prodotto da Bracco SpA, Milano, Italia), avendo per questo studiato la dipendenza da entrambi i parametri che maggiormente ne influenzano le proprietà acustiche: tempo e temperatura. Con la tecnica fotoacustica si è messa in evidenza l’esistenza di un’effettiva dipendenza dell’effecienza dell’UCA dalla temperatura, intesa come l’incremento prodotto sul segnale acustico restituito dall’organo nella situazione in cui questo sia attraversato dall’agente di contrasto rispetto a quella in cui questo non sia invece presente. Tale dipendenza può essere messa in relazione con il comportamento tipico del guscio di natura fosfolipidica che racchiude le singole microbolle, il quale, proprio in corrispondenza dell’intervallo di temperatura considerato nell’analisi degli UCA (25-45 °C), mostra un cambiamento di fase. Quindi, proprio questo comportamento potrebbe essere utilizzato come proprietà termometrica per la realizzazione di un termometro non invasivo, il quale risulterebbe molto utile in alcune terapie mediche come l’ipertermia, in cui è richiesto un monitoraggio permanente della temperatura degli organi interni durante il trattamento medico. Tale tipo di studio, inoltre, è stato condotto anche in funzione delle caratteristiche microscopiche degli agenti di contrasto, mediante la stima della tensione superficiale efficace del guscio delle microbolle che li costituiscono. L’analisi eseguita con la tecnica a impulsi ultrasonori ha permesso di conoscere il decadimento temporale dell’efficienza degli agenti contrasto, anche in accordo con quanto ottenuto con il metodo fotoacustico, e di mettere in luce la loro natura di ‘scatteratori’ non lineari degli impulsi ultrasonori. È interessante infine sottolineare che, con questo metodo, la valutazione dell’efficienza dell’UCA si esegue nell’intervallo di frequenze tipicamente utilizzato negli strumenti ecografici, dovendo questo coincidere con quello della banda passante degli agenti di contrasto.