Venetoclax in Acute Myeloid Leukemia: from the in vivo experience to the development of an in vitro model of acquired resistance.

INTRODUZIONE: La leucemia mieloide acuta (LMA) è una neoplasia emopoietica geneticamente eterogenea che colpisce tutte le fasce d'età, ma in particolare gli individui più anziani. La chemioterapia convenzionale seguita da trapianto allogenico di cellule staminali (HSCT) offre le migliori possibilità di sopravvivenza a lungo termine, ma questo approccio intensivo comporta un tasso relativamente elevato di morbilità e mortalità correlate al trattamento e non è adatto a pazienti non idonei e/o anziani. Il trattamento di scelta per i pazienti considerati candidabili alla terapia less intensive è attualmente rappresentato da regimi contenenti ipometilanti + Venetoclax (VEN), un inibitore di BCL2, che ha mostrato tassi di risposta elevati e duraturi. Tuttavia, nonostante l'elevata efficacia del VEN, alcuni pazienti sviluppano graduale resistenza primaria o secondaria al farmaco. OBIETTIVO DELLO STUDIO: Questa tesi di dottorato mira a esplorare il ruolo del VEN nella LAM, integrando le evidenze cliniche in vivo con studi preclinici in vitro. Il primo obiettivo è stato quello di valutare una coorte di pazienti real-life con LAM trattati con agenti ipometilanti-VEN, al fine di identificare fattori predittivi di risposta e resistenza alla terapia, confrontandoli con i recenti risultati in letteratura. Inoltre, considerando l'aspetto traslazionale dello studio, abbiamo cercato di identificare nuovi determinanti della resistenza al VEN, in particolare quelli correlati all'acquisizione di fenotipi metabolici peculiari. Successivamente, lo studio si è concentrato sullo sviluppo di un modello di linea cellulare resistente al VEN e sulla sua caratterizzazione funzionale e metabolica. MATERIALI E METODI: Lo studio ha incluso 13 pazienti affetti da LAM eleggibili alla terapia con agenti ipometilanti-VEN e afferenti all'Unità Operativa di Ematologia dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria "A.O.U. Sant'Andrea", Sapienza di Roma, da gennaio 2022 a dicembre 2025. La diagnosi di LAM è stata effettuata secondo i criteri dell’European LeukemiaNet (ELN 2022). La coorte è stata stratificata in gruppi di rischio favorevole (n=4), intermedio (n=1) e avverso (n=5). Inoltre, 3 pazienti presentavano malattia recidivante o refrattaria (R/R). I pazienti con malattia in risposta parziale o in progressione di malattia hanno rappresentato il nostro modello in vivo. Il modello in vitro di resistenza al VEN è stato generato utilizzando la linea cellulare U937, ad ontogenesi mieloide. Il clone sensibile e quello resistente sono stati confrontati in termini di: profilo di espressione delle proteine regolatrici dell’apoptosi, tramite Western Blot; sensibilità al trattamento con inibitori di vie di segnalazione intracellulare o di modulatori del metabolismo, mediante saggi di vitalità cellulare; cambiamenti del profilo metabolico analizzati mediante piattaforma Seahorse Analyzer. RISULTATI: I risultati ottenuti nei pazienti valutati in termini di outcome clinico sono simili a quelli pubblicati in letteratura, in particolare per i fattori prognostici di risposta. I risultati ottenuti con il Mitostress indicano una risposta omogenea in termini di respirazione basale e massimale tra i 3 pazienti con LMA analizzati alla diagnosi, mentre i due casi di ricaduta presentano un pattern bioenergetico divergente. Per i due pazienti in cui l'analisi metabolica è stata eseguita sia alla diagnosi che alla recidiva il Mitostress ha mostrato livelli di respirazione basale e massimale divergenti al momento della recidiva. Inoltre, i risultati ottenuti durante la fase refrattaria alla VEN evidenziano un marcato aumento dell'OCR (sia della respirazione basale che di quella massima). Per quel che riguarda l’analisi in vitro, mediante analisi con Western Blot abbiamo osservato che il sub-clone resistente mostra una aumentata espressione di pMcl-1, noto fattore di resistenza. I saggi MTT eseguiti utilizzando un inibitore di PI3K (BKM120) e un inibitore di CPT1 (ST1326) mostrano che il clone resistente mantiene la sensibilità ad inibitori di altre vie di segnalazione intracellulare o altri pathways metabolici, riprogrammandone anche il fenotipo bioenergetico. CONCLUSIONI: Il nostro studio rappresenta un'esperienza real-life di pazienti affetti da LMA, eleggibili a chemioterapia meno intensiva, trattati con agenti ipometilanti-VEN. L'acquisizione sistematica di campioni all'esordio, alla risposta e alla recidiva potrebbe portare a una maggiore comprensione dei meccanismi di resistenza in vivo (che potrebbero essere parzialmente sovrapponibili a quelli in vitro), nonché alla definizione di un profilo prognostico di risposta e/o resistenza alla terapia con VEN. L’analisi clinica, lo studio metabolico traslazionale e il modello preclinico rappresentano l'approccio “from bedside to bench, and back again” utile a fornire preziose informazioni nel paziente trattato con target therapy. Tuttavia, è necessario un aumento della dimensione del campione per ottenere dati più robusti e riproducibili, che ci consentano di trarre conclusioni accurate.