Isolamento di Outer Membrane Vesicles da ceppi di Escherichia coli patogeni: ottimizzazione e implicazioni One Health

Summary Outer membrane vesicles (OMV) are key mediators of pathogenesis in bacteria, involved in the delivery of virulence and immunomodulatory factors. To standardize the overall recovery of OMV from bacterial cultures, we compared in terms of quality, quantity, morphology and size, OMV from Uropathogenic (UPEC) and Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), obtained using differential ultracentrifugation (dUC) and size-exclusion chromatography (SEC). As for electron microscopy, between the two fractions obtained by dUC (F1 and F2), F2 showed fewer contaminants than F1, while SEC provided more homogeneous preparations. Nanoparticle tracking and Dynamic Light Scattering analyses revealed uniform OMV in UPEC-SEC samples, while STEC-SEC samples were more polydisperse. ζ-potential confirmed higher colloidal stability in UPEC-SEC (-10±2.6mV) compared to STEC-SEC (-2,1±1.4mV). Both methods are effective, but SEC yielded higher quality OMV. Optimizing OMV isolation is crucial for downstream applications in diagnostics and research in a One Health context. Introduzione Le vescicole di membrana esterna (Outer Membrane Vesicles, OMV) sono strutture proteolipidiche che originano dalla membrana esterna batterica e contribuiscono al rilascio di tossine, fattori di resistenza antimicrobica, materiale genetico e molecole coinvolte in processi infettivi e immunomodulatori (1). Nei ceppi uropatogeni di Escherichia coli (UPEC) e in quelli produttori di Shiga tossina (STEC), rispettivamente responsabili di infezioni genito-urinarie e gastrointestinali nell’uomo, le OMV giocano un ruolo attivo nella patogenesi, facilitando l’interazione con l’ospite e la disseminazione di fattori di virulenza (2, 3). Negli ultimi anni, le OMV hanno acquisito un interesse crescente come potenziali biomarcatori diagnostici, vettori vaccinali e strumenti per la caratterizzazione molecolare dei patogeni, in particolare in ambito One Health (4). Studi recenti hanno evidenziato la presenza di cloni UPEC condivisi tra isolati umani e animali, supportando l’ipotesi di un potenziale zoonotico (5). Parallelamente, l’isolamento di ceppi STEC da matrici alimentari evidenzia l’importanza del monitoraggio lungo la filiera agroalimentare per prevenire la trasmissione di patogeni emergenti (6). In questo contesto, l’ottimizzazione dei protocolli di isolamento delle OMV assume un ruolo fondamentale per promuoverne l’applicabilità in ambito diagnostico, clinico e di sanità pubblica. Tecniche come l'ultracentrifugazione (UC) e la cromatografia a esclusione di taglia (Size-Exclusion Chromatography, SEC), sono comunemente utilizzate per isolare le OMV (4). Tuttavia, ogni metodo presenta vantaggi e svantaggi in termini di integrità, purezza e resa del preparato, e la scelta del metodo di isolamento è fondamentale per le potenziali applicazioni (diagnostica, caratterizzazione molecolare/funzionale). In questo studio, abbiamo confrontato morfologia, dimensione e concentrazione delle OMV prodotte da un ceppo UPEC LC2, isolato da una paziente con infezione del tratto urinario ricorrente, e da un ceppo STEC O80:H2, isolato da un campione di latte, ottenute utilizzando UC differenziale (dUC) e SEC. Il nostro obiettivo è stato quello di ottimizzare la qualità del recupero delle OMV e di contribuire alla comprensione della dinamica di infezione di ceppi con potenzialità zoonotica, in un’ottica integrata nel paradigma One Health. Materiali e metodi Per entrambi i ceppi, le OMV sono state purificate via dUC utilizzando due step sequenziali a 100.000 e 200.000 x g di 2 ore ciascuno, ottenendo due frazioni arricchite in OMV (F1 e F2), e via SEC, dalle stesse colture batteriche cresciute per 18 h a 37°C, in tre replicati biologici. Le OMV ottenute sono state analizzate in microscopia elettronica (EM), Dynamic Light Scattering (DLS) e Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) per definirne la morfologia, dimensione e concentrazione. L’analisi DLS ha inoltre permesso di esplorare l’uniformità delle particelle in sospensione (Polydispersity Index, PDI) e la loro carica superficiale (ζ-potential). Risultati e Discussione L’osservazione in EM delle frazioni di UC di entrambi i ceppi ha mostrato la presenza nella F1di poche OMV e molti detriti cellulari e contaminanti, tra cui pili e flagelli. L’analisi della F2, invece, ha mostrato una preparazione con un maggior numero di vescicole e una ridotta presenza di contaminanti, similmente a quanto osservato nelle preparazioni SEC. Pertanto, la F2 è stata selezionata per ulteriori caratterizzazioni e confrontata con le preparazioni SEC. Per il ceppo STEC, l’NTA ha mostrato una concentrazione media di (3,96 ± 0,22) x 109 particelle/ml per la F2 e di (6,72 ± 0,20) x 1010 particelle/ml per le OMV isolate con SEC, con un diametro medio di 164,3 ± 29,4 nm e 120,5 ± 25,6 nm, rispettivamente. Per UPEC, la concentrazione media era di (3,06 ± 0, 77) x 1010 particelle/ml nella F2 e di (2,86 ± 0,36) x 1010 particelle/ml nella preparazione SEC, con diametri medi rispettivamente di 186,9 ± 32,8 nm e 162,2 ± 28,3 nm. In generale, la F2 da UC mostrava una popolazione di particelle relativamente omogenea, paragonabile a quella ottenuta con SEC. I dati DLS hanno confermato che, nei campioni UPEC, le preparazioni SEC erano più uniformi in termini dimensionali (~170 nm) in quanto caratterizzate da un valore di PDI <0,23 rispetto alla F2 da UC, caratterizzata invece da un raggio idrodinamico medio di ~342 nm e da un valore di PDI di 0,58. Per STEC, invece, le preparazioni SEC presentavano OMV di dimensioni inferiori (~265 nm), ma con un indice di polidispersione elevato (PDI fino a 0,60), indicando una minore omogeneità rispetto a UPEC. In termini di ζ-potential, parametro predittivo della stabilità colloidale delle vescicole, i campioni UPEC-SEC presentavano un valori moderatamente negativi (-10 ± 2,6 mV), mentre quelli di STEC erano più prossimi alla neutralità (2,1 ± 1,4 mV), suggerendo una maggiore tendenza a fenomeni di aggregazione. Le frazioni UC-F2, invece, mostravano valori di ζ-potential generalmente più negativi (fino a -21,3 mV) rispetto ai campioni SEC, indicativi di una maggiore stabilità colloidale. Questi risultati evidenziano che il metodo di isolamento incide non solo sulla purezza e omogeneità delle OMV, ma anche sulla loro stabilità colloidale, con le UC-F2 che mostrano un profilo elettrostatico più favorevole alla stabilità in sospensione. Nel complesso, i dati suggeriscono che la centrifugazione sequenziale consente di ottenere frazioni (F2) con una riduzione accettabile di materiali indesiderati, potenzialmente interferenti con le indagini a valle, e una buona stabilità colloidale. Tuttavia, il metodo SEC si è dimostrato particolarmente adatto, soprattutto per UPEC, a isolare preparazioni arricchite in OMV di dimensioni uniformi, con buone proprietà colloidali, comparabili a quelle ottenute tramite UC a 200.000 x g. Nel caso di STEC la maggiore eterogeneità osservata nei campioni SEC indica la necessità di ulteriori ottimizzazioni. I risultati ottenuti confermano che la scelta del metodo di isolamento influisce significativamente sulle caratteristiche qualitative e funzionali delle OMV, condizionandone la successiva applicabilità in studi molecolari, immunologici e diagnostici. Considerato il ruolo delle OMV nella patogenesi, modulazione della risposta immunitaria e come candidati vaccinali, la loro caratterizzazione standardizzata rappresenta è essenziale per valutarne l’utilizzo come biomarcatori e per approfondire lo studio e la prevenzione delle infezioni da ceppi zoonotici, in un’ottica integrata One Health.