Attività di una soluzione fisiologica ozonizzata aggiunta a colture cellulari in vitro

L'ozono è stato impiegato con successo in diversi settori: dalla potabilizzazione delle acque, al trattamento di ferite e ulcere difficili, all'induzione di fenotipi anti-infiammatori nelle cellule dell'immunità alla capacità di adiuvare gli effetti di molti composti farmacologici nel trattamento di patologie cronico-degenerative e nella terapia del dolore. Attualmente l'ozono viene impiegato per uso topico forma di olio ozonizzato per promuovere la guarigione delle ferite e per il trattamento delle ulcere difficili grazie alle e rigenerative per sue capacità battericide la riparazione dei il trattamento di malattie tessuti. neurodegenerative, ortopediche, cardiovascolari, gastrointestinali, genito-urinarie dermatologiche, l'ozono aggiunto al sangue prelevato dal soggetto e reinfuso oppure l'ozono viene insufflato. L'ozono, più solubile dell'O2 si scioglie nella componente acquosa sangue e istantaneamente reagisce con molti substrati, ossidando l'acido ascorbico, gli urati, la cisteina libera, il glutatione e gruppi SH dell'albumina. La piccola frazione di albumina ossidata viene prontamente rimossa dal circolo senza alterazione dei livelli plasmatici. Quando il sangue entra in contatto con la miscela 02-03, l'ozono disciolto reagisce con biomolecole anti-ossidanti e PUFA formando H202 e LOPs. H2O2 viene prontamente ridotta a H20 da GSH e catalasi. Lo scopo del presente studio è quello di analizzare gli effetti indotti una soluzione fisiologica ozonizzata aggiunta a sistemi cellulari in vitro per valutare l'eventuale tossicità e la capacità di indurre una risposta anti-ossidante e anti-infiammatoria. Materiali e Metodi: Abbiamo utilizzato la linea cellulare BV2, costituita da elementi microgliali, e colture primarie ottenute da cellule endoteliali umane (HUVEC Human umbilical vein endothelial cell). In breve, O3 alle concentrazioni di 1, 5 e 10 ug/Nml, miscelato nella soluzione salina (fisiologica NaCl 0,9%) è stato aggiunto a 500.000 cellule BV2 in coltura (200 microlitri soluzione fisiologica contenente 03, aggiunti a 3,8 ml DMEM 10% FBS) ) e le cellule sono state incubate per 24 h a 37°C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 Le cellule sono state poi analizzate in un test di citotossicità utilizzando il colorante vitale Trypan Blue. Lo stesso trattamento è stato effettuato con colture primarie di cellule HUVEC. E' stato inoltre estratto dalle cellule trattate con ossigeno-ozono e dalle colture di controllo I'RNA totale utilizzando il kit miRNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Germania) e quantificato con NanoDrop One/OneC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Il cDNA è stato generato utilizzando il kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) è stata eseguita per ciascun campione in triplicato su un sistema Applied Biosystems 7900HT Fast real-rime PCR (Applied Biosystem, Cheshire, Regno Unito) utilizzando il programma SDS2.1.1 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) con la Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). I primers per l'amplificazione della real-time PCR sono stati progettati con UCSC GENOME BROWSER (http://genome,cse.ucsc. edu/; Università della California, Santa Cruz). Le sequenze delle coppie di primers sono state abbinate tramite BLASTn alla sequenza del genoma per identificare le posizioni dei primers rispetto agli esoni. Per analizzare i dati della real-time PCR è stato utilizzato il metodo del ciclo soglia comparativo (CT). La quantità target, normalizzata rispetto al riferimento endogeno del primer Bactina (DCT) e relativa al calibratore del controllo non trattato, è stata calcolata con l'equazione 2 -DDCT. Risultati: L'aggiunta di O3 1, 5, 10 Microgrammi N/ml alle colture di cellule microgliali non ha indotto citotossicità fino alla concentrazione di 5 microgrammi. Un analogo trattamento condotto su colture primarie di cellule endoteliali ha stabilito che a 24 ore non si osserva una citotossicità significativa che viene però incrementata prolungando l'incubazione a 48 h, ma che uguaglia la % di cellule morte misurata nelle colture di controllo. Sono stati effettuati esperimenti per valutare l'attività anti-ossidante indotta dall'aggiunta di O3 a colture di cellule microgliali. I risultati ottenuti, valutando l'espressione degli RNAm per Nrf2 e SOD1 hanno dimostrato che a 24 h il trattamento con O3 alle concentrazione di 5 e 10 microgrammi induceva un aumento dell'espressione degli RNAm per Nrf2 e SOD1, indicando che l'aggiunta di O3 aveva stimolato la risposta anti-ossidante delle cellule. Sono tuttora in corso esperimenti per valutare l'espressione intracellulare di ROS mediante test in immunofluorescenza e citometria a flusso. E' inoltre in corso di valutazione 'attività anti-infiammatoria dell'O3 aggiunto alle colture di microglia in assenza o presenza di LPS. Verrà analizzata la polarizzazione delle cellule microgliale in senso pro o anti-infiammatorio (Ml o M2) mediante analisi dell'espressione di citochine e markers fenotipici.