Role of IL-23/IL-17 axis in the development of atherosclerotic plaque

Atherosclerosis is the main cause of death in industrialized countries and, more recently, it has also started to affect developing countries. The immune system plays a key role in the disease progression. Both innate and adaptive immunity cells are involved in the inflammatory response. Macrophages, belonging to the innate immunity, are plastic cells and their phenotype can be influenced by the surrounding microenvironment. Indeed, these cells can polarize into two types of macrophages: one characterized by a proinflammatory phenotype, called M1, which promotes inflammation by releasing proinflammatory cytokines, and one characterized by an anti-inflammatory phenotype, M2, which releases anti-inflammatory cytokines. In human atherosclerotic plaques the localization of M1 and M2 is different. Indeed, M1 macrophages are aggregated on the shoulders of the vulnerable plaques while M2 macrophages are present in the stable region away from the lipid core. Cytokines can drive macrophages’ phenotype and functions. IL-23 is a proinflammatory cytokine involved in various inflammatory and autoimmune diseases, which may also play a role in the development of atherosclerosis. IL-23 binds to its receptor IL-23R and IL-12Rβ1 and activates the JAK/STAT signaling pathway via STAT3, releasing cytokines such as IL-17A, IL-22 and IL-6. Our study focused on investigating the role of IL-23 in atherosclerosis. In particular, we analysed the role of IL-23 in macrophage polarization by Real-Time PCR, immunoenzymatic assay, flow cytometry and immunofluorescence. The analysis was carried out both on macrophages derived from THP-1 cell line models and on macrophages derived from monocytes obtained from healthy donors. Results regarding macrophages derived from human leukemia THP-1 cell line showed that IL-23 promotes the expression of the pro-inflammatory cytokines IL-1ß, IL-6 and TNF-α in M0 macrophages, suggesting the induction of macrophage activation. It also led to an increase in the expression of IL-10 in all populations studied. In inflammatory conditions, after the stimulation with lipopolysaccharide (LPS), IL-23 increased the expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α and IL-10 levels in all macrophage phenotypes, suggesting a synergic action with LPS. Experiments on macrophages derived from healthy donors’ monocytes did not give the same results. Indeed, IL-23 induced the expression and release of IL-6 in all subpopulations examined, while the expression of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-10 only increased in M1 macrophages in pro-inflammatory conditions. Furthermore, IL-23 induced M1 macrophages migration suggesting a chemotactic function. Another surprising phenomenon observed was that all macrophages produced IL-17A, with resting macrophages representing the main source of production. IL-23 also induced an increase in the expression of IL-22 and IL-10 in resting macrophages and, in association with LPS and IFN-γ, it potentiated the expression and production of IL-17A and IL-10, suggesting a synergic action between LPS and IL-23. Indeed, the stimulation with IL-23 increased both CD86 and CD206 surface markers, although, CD86 appeared to be prevalent. The immunofluorescence analysis showed that all macrophages produce IL-17A and that IL-23 increases its production, while the immunohistochemistry analysis confirms the presence of macrophages and IL-17A in atherosclerotic plaques and their co-localization.

Le malattie cardiovascolari costituiscono la principale causa di morte nei paesi industrializzati e, in tempi più recenti, hanno iniziato ad interessare anche i paesi in via di sviluppo (Libby P. et al., 2021); prendono origine dallo sviluppo della placca aterosclerotica che si forma in seguito all’accumulo di lipidi e cellule immunitarie nella regione sub-endoteliale delle arterie di grande e medio calibro. Il sistema immunitario, attraverso la risposta innata e adattativa, svolge un ruolo importante nello sviluppo, progressione o regressione dell’aterosclerosi. I macrofagi, cellule dell’immunità innata, sono dotati di un elevato grado di plasticità in risposta agli stimoli del microambiente circostante. In particolare, si definiscono macrofagi “classicamente attivati” o pro-infiammatori di tipo M1, i macrofagi stimolati con citochine di tipo Th1 (IL-1β, TNF-α e IFN-γ) e lipopolisacaride (LPS) (Abbas S.M. et al., 2018). In risposta a questi stimoli, i macrofagi si attivano e si differenziano in macrofagi ad attività pro-infiammatoria. La via di segnalazione canonica è quella mediata da IRF/STAT tramite il reclutamento di STAT1 che termina con l’attivazione del fattore di trascrizione NF-kB che a sua volta regola l’espressione di citochine e chemochine quali IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-23 responsabili di un ulteriore reclutamento di cellule immunitarie infiammatorie e dell’amplificazione dell' infiammazione (Abbas S.M et al., 2018). Le citochine di tipo Th2 (IL-4, IL-13) inducono macrofagi M2 o “alternativamente attivati” attraverso la via di segnalazione canonica IRF/STAT con il reclutamento di STAT6. I macrofagi così attivati rilasciano citochine anti-infiammatorie quali IL-10 e l’antagonista del recettore per IL-1β. Le citochine IL-4 e IL-13 inducono un sottotipo di M2 caratterizzati dall’espressione di alti livelli di CD206 (sottotipo M2a), mentre l’interazione dei macrofagi con immunocomplessi e LPS produce il sottotipo M2b che produce citochine sia pro- che anti-infiammatorie (IL-10, IL- 1β, IL-6 e TNF-α). La stimolazione dei macrofagi con glucocorticoidi e IL-10 attiva il sottotipo M2c che produce prevalentemente le citochine anti-infiammatorie IL-10 e TGF-β, infine gli agonisti dei TLR attraverso il recettore dell’adenosina promuovono la polarizzazione dei macrofagi verso il sottotipo M2d che rilascia citochine anti-infiammatorie ed il fattore di crescita VEGF (Lin P. et al., 2021; Liu N. et al., 2021; Mohmmad-Rezaei M., et al., 2021) IL-23, prodotta principalmente da cellule dendritiche e macrofagiche, si lega al recettore eterodimerico IL-12Rβ1 e IL-23R e attiva la via di segnalazione JAK/STAT mediante STAT3, rilasciando citochine pro-infiammatorie quali IL-17A (Ergberg A. et al., 2020). Nonostante sia stato ampliamente riportato il ruolo pro-infiammatorio di IL-23 in varie patologie come le malattie infiammatorie intestinali, l’artrite reumatoide e la psoriasi (Erbel C. et al., 2014; Abbas et al., 2015; Hawkes JE et al, 2018; Hou Y. et al, 2018; Bianchi E et al, 2019; Liu T. et al., 2020) ancora non è del tutto chiaro il suo ruolo nell’aterosclerosi, oggetto del mio progetto di dottorato. Dato che i macrofagi svolgono un ruolo importante nella placca aterosclerotica ed il microambiente circostante può influire sulla loro polarizzazione, è stato inizialmente studiato il ruolo di IL-23 sulla polarizzazione dei macrofagi utilizzando, come sistema sperimentale, cellule mononucleate (PMCs) provenienti da sangue periferico di donatori sani. I PMCs sono stati indotti a differenziare in vitro in macrofagi mediante l’aggiunta del fattore di differenziazione M-CSF per 6 giorni, successivamente sono stati polarizzati in senso M1(MIFN), aggiungendo LPS (10ng/ml) ed IFN-γ (10ng/ml), oppure verso il fenotipo M2 (MIL-10 o MIL4), aggiungendo IL-10 (10ng/ml) o IL-4 (10ng/ml) per 18ore. Inizialmente è stata valutata la citotossicità di IL-23 in macrofagi M0, MIFN e MIL-4 mediante il saggio Trypan blue, utilizzando tre concentrazioni diverse di IL-23 (10ng/ml; 50ng/ml e 100ng/ml) e LPS (10ng/ml) per 8h. I risultati ottenuti hanno mostrato che IL-23 non induce tossicità in nessuna delle concentrazioni studiate e per nessuno dei trattamenti eseguiti. Le successive analisi sulle citochine pro-infiammatorie (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e quelle antiinfiammatorie (IL-10), mediante Real-Time PCR e saggi immunoenzimatici, hanno evidenziato che IL-23 (100ng/ml) induce significativamente l' espressione e il rilascio di IL-6 in tutte le sottopopolazioni esaminate (RT-PCR; M0=3,1646 volte superiore al controllo, MIFN= 1,24924 volte superiore rispetto al controllo, MIL-4= 2,87917 rispetto al controllo. Test ELISA; M0= 24,462 pg/ml, MIFN= 50,7804 pg/ml, MIL-4=110,101 pg/ml), mentre in condizioni pro-infiammatorie, ovvero in presenza di LPS (10ng/ml) per i macrofagi MIFN e MIL-4 o LPS (200ng/ml) e IFN-γ (25ng/ml) per i macrofagi M0, IL-23, aumenta significativamente l' espressione di IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10 solo nei macrofagi MIFN (IL-1β; 24,0926 volte superiore rispetto al controllo, IL-6; 33,16 volte superiore rispetto al controllo; TNF-α; 3,23344 volte superiore rispetto al controllo) (n=4 prove). Per valutare se IL-23 possa intervenire anche nel reclutamento delle cellule monocito-macrofagiche, visto che quest’ultime migrano nel sito target all' interno dei tessuti guidati da un' ampia gamma di agenti chemiotattici, sono stati effettuati saggi di migrazione in camere di Boyden in presenza delle tre concentrazioni di IL-23 precedentemente testate (10ng/ml,50ng/ml e 100ng/ml). Dai risultati è emerso che l’effetto maggiore si riscontra significativamente su cellule MIFN esposte a una concentrazione di IL-23 pari a 50 ng/ml e il valore risulta essere superiore al 50% rispetto all’effetto prodotto da MCP-1, mentre nei macrofagi MIL-4 l’effetto chemiotattico prodotto da IL-23 risulta essere inferiore al 50% rispetto all’effetto prodotto da MCP-1. A causa della difficoltà di reperire donatori di sangue durante il periodo di chiusura per pandemia COVID-19, è stata utilizzata la linea cellulare monocitica umana THP-1. Le cellule THP-1 sono state coltivate in presenza di PMA per 24 ore e dopo un periodo di resting sono state polarizzate in senso M1, M2a e M2c o lasciate non polarizzate M0. Le cellule sono state successivamente stimolate con IL-23 (100ng/ml) e in presenza o assenza di stimolo pro infiammatorio (LPS 10ng/ml o 200ng/ml IFN-γ 25ng/ml) per 8 ore. I risultati ottenuti mediante Real-Time PCR (n=3 prove), focalizzando sempre sulla polarizzazione dei macrofagi, hanno mostrato che nella sola popolazione di macrofagi M0, IL-23 induce l' espressione significativa delle citochine pro-infiammatorie IL-1ß (2,24255 volte superiore rispetto al controllo), IL-6 (3,28573 volte superiore rispetto al controllo) e TNF-α,(2,319 volte superiore al controllo) suggerendo un'azione pro-infiammatoria e l' attivazione dei macrofagi, mentre negli altri sottotipi non induce alcun cambiamento dell'espressione delle citochine pro-infiammatorie. I risultati hanno, inoltre, mostrato che in tutte le popolazioni studiate, IL-23 induce un aumento significativo dell' espressione di IL-10 (M0=3,09279 volte superiore rispetto al controllo, M1=1,54044 volte superiore rispetto al controllo; M2a=1,80495; M2c=1,77277 volte superiore rispetto al controllo). Il co-trattamento di LPS con IL-23 aumenta significativamente l' espressione di IL-1β (M0=11,7636 volte superiore rispetto al controllo; M1= 1,51246 volte superiore rispetto al controllo; M2a=8,83959 volte superiore rispetto al controllo; M2c=16,142 volte superiore rispetto al controllo), IL-6 (M0=356,572 volte superiore rispetto al controllo; M1=2,15239 volte superiore rispetto al controllo; M2a= 221,005 volte superiore rispetto al controllo; M2c=509,872 volte superiore rispetto al controllo), TNF-α (M0=8,03037 volte rispetto al controllo; M1=1,54109; M2a=7,04826 volte superiore rispetto al controllo; M2c= 16,2489 volte superiore rispetto al controllo) e IL- 10 (M0=29,1812 volte superiore rispetto al controllo; M1=2,4427 volte superiore rispetto al controllo; M2a= 16,9109 volte superiore rispetto al controllo; M2c=48, 8999 volte superiore rispetto al controllo) in tutti i fenotipi di macrofagi, suggerendo che IL-23 abbia un' azione sinergica con LPS aumentando l' infiammazione. Un recente studio condotto sul modello murino di Hou Y. e colleghi ha rilevato che IL-23 induce la produzione di IL-17A, IL-17F, IL- 22 e IFN-γ nei macrofagi peritoneali (Hou Y. et al, 2018). Conseguentemente la nostra attenzione si è spostata sul pathway IL-23/IL- 17. I macrofagi M0, derivati da monociti circolanti, sono stati polarizzati e trattati con IL-23 (100ng/ml) in presenza o assenza di stimolo pro infiammatorio (LPS 10ng/ml o LPS 200ng/ml e IFN-γ 25ng/ml) per 8 ore. Le cellule trattate sono state analizzate mediante Test ELISA per la produzione di IL-17A, IL-22 e IL-10. I risultati ottenuti hanno mostrato come, sorprendentemente, tutti i macrofagi analizzati producano IL-17A (M0= 29,0382 pg/ml, MIFN= 4,5216 pg/ml e MIL-4= 20,58212 pg/ml) e i macrofagi non differenziati ne rappresentano la principale fonte di produzione. Inoltre, i macrofagi MIFN sono gli unici macrofagi che producono IL-22 (2,05 pg/ml), mentre, come è ormai noto, gli M2 sono i principali produttori di IL-10 (462,4 pg/ml). Sulla base di questi risultati, l' attenzione si è focalizzato sulla popolazione non ancora differenziata di macrofagi, M0. Sono state quindi analizzate l'espressione degli mRNA e la produzione delle citochine IL-17A, IL-22, IL-10, coinvolte nell' asse IL-23/IL-17, in macrofagi derivati da monociti di donatori sani. I risultati hanno evidenziato che IL-23 induce un aumento significativo dell' espressione degli RNA messaggeri e conseguente produzione di IL-17A nei macrofagi M0, mentre in associazione con LPS e IFN-γ potenzia significativamente l' espressione e il rilascio di IL-17A e IL-10, suggerendo che LPS abbia un'azione sinergica con IL-23. L’analisi in immunofluorescenza con doppia marcatura (CD86 e IL-17A) ha permesso non solo di confermare la produzione di IL-17A ma anche di verificare che la popolazione esaminata sono macrofagi (CD86+). Analizzando il pathway a valle di IL-23 i risultati hanno confermato l’induzione significativa dell' espressione di STAT3, seppur lieve, a seguito del trattamento unicamente con IL-23. Lo studio dell’espressione e della presenza dei marcatori di superficie permette di classificare il fenotipo dei macrofagi prodotti in seguito alla stimolazione con IL-23. L' analisi dei marker di superficie, mediante citometria a flusso, ha mostrato che i macrofagi M0, stimolati con IL-23 (100ng/ml), inducono un fenotipo poco chiaro. Infatti, questa stimolazione ha mostrato un aumento significativo del marcatore M1 (CD86) (MFI= 4,5) rispetto alle cellule non trattate ma anche del marcatore M2 (CD206) (MFI= 1,04667). Tuttavia, il marcatore di superficie CD86 sembra essere più diffuso. L’analisi morfologica e morfometrica di placche umane, stabili e complicate, ha evidenziato una maggiore presenza di IL-17A e CD86 nelle placche complicate rispetto alle placche stabili. L’analisi in immunofluorescenza effettuata su sezioni di placca aterosclerotica umana ha confermato la presenza di IL-17A nei macrofagi CD86 positivi nelle placche aterosclerotiche (Pearson's coefficient= 0.738)