Efficacia in vitro e in vivo dell’olio essenziale di Cinnamomum zeylanicum in nanoformulati e in sinergia con fluconazolo verso isolati di C. auris

Introduzione. C. auris è un patogeno emergente particolarmente attenzionato a livello mondiale in quanto resistente ai principali antifungini, viene spesso identificato dalle analisi di routine in maniera erronea, genera focolai tra pazienti ospedalizzati ed è resistente a disinfettanti di utilizzo comune (1). Tra le poche alternative ad oggi disponibili, l’olio essenziale di Cinnamomum zeylanicum (OE-CZ) potrebbe essere un ottimo strumento da impiegare nella lotta contro C. auris, grazie alle sue proprietà antifungine (2). Materiali e metodi. I ceppi clinici di C. auris sono stati ottenuti da emocolture positive e sottoposti a test di sensibilità agli antifungini e a 15 oli essenziali mediante tecnica della micro-diluizione. Per individuare la frazione attiva e migliorare il delivery, l’OE-CZ è stato sia frazionato con cromatografia liquida su colonna a bassa pressione che nano-incapsulato in particelle di policaprolattone (PCL). Di OE-CZ e dei prodotti della sua lavorazione è stata valutata sia la qualità chimica (GC-MS accoppiato allo spazio di testa) che l’efficacia antifungina unitamente alle principali componenti delle frazioni. La tossicità e l’efficacia di OE-CZ libero (L-OE-CZ) e nano-incapsulato (N-OE-CZ) sono state testate in vivo su G. mellonella. Il metodo di titolazione a scacchiera è stato usato per valutare la sinergia tra l’L-OE-CZ o N-OE-CZ e gli antimicotici (fluconazolo e micafungina). Il meccanismo d’azione è stato indagato valutando l’attività ATPasica in cellule di C.auris mediante kit ELISA, e la quantità di fluconazolo intracellulare con UPLC-MS/MS. Risultati. Tra i diversi OEs testati, l’OE-CZ era il più attivo (MIC90=0,06% v/v; MFC90=0,06% v/v). Tutti i ceppi di C. auris mostravano resistenza al fluconazolo (MIC>1024 μg/ml). La cinnamaldeide è il maggior costituente di L-OE-CZ (66,1 %). L’analisi dello spazio di testa indica che la quantità di quest’ultima aumentava da L-OE-CZ (24.2%) a di N-OE-CZ (80,1%) con una conseguente migliore efficacia (MIC90 ed MFC90=0.02 % v/v). Solo L-OE-CZ mostrava sinergia con il fluconazolo (FIC = 0,26 ± 0,14) e con la micafungina (FIC= 0,23 ± 0,13 e FIC=0,32 ± 0,13). In vivo, nessuna concentrazione di L-OE-CZ testata è risultata tossica e l’efficacia migliore era data dalla sinergia individuata in vitro (fluconazolo 2,5 μg/mL + OE 0,002% v/v) con parallela diminuzione dell’attività ATPasica (p<0,0001) e aumento della quantità di fluconazolo (p<0,002) intracellulare rispetto al controlli non trattati. Conclusioni e discussione. L’analisi di qualità dell’OE di C. zeylanicum individua la cinnamaldeide (66.1%) e il cinnamil-acetato (5.5%) come principali componenti. La nanoincapsulazione dell’OE comporta l’incorporazione selettiva di specifici principi attivi, come cinnamaldeide ed eugenolo, con il conseguente incremento delle proprietà antifungine del formulato. Dai test di sinergia emerge che solo L-OE-CZ va in sinergia con il fluconazolo e con la micafungina, mentre N-OE-CZ perde questa proprietà: ciò è probabilmente dovuto alla mancanza di componenti importanti minoritari del fitocomplesso che vengono persi nel processo di incapsulazione. I dati in vivo indicano sia la sicurezza d’uso delle concentrazioni testate che l’efficacia della sinergia tra OE e fluconazolo. Sebbene non sia ancora noto il meccanismo con cui L-OE-CZ agisca sul meccanismo di resistenza della cellula è possibile presupporre che questo coinvolga l’inibizione delle pompe di efflusso attivo ATP dipendenti permettendo al farmaco di permanere nella cellula e agire come farebbe in cellule di Candida spp. sensibili