Microglia e Sistema Endocannabinoide: ruolo di URB597 in un modello in vitro di neuroinfiammazione

La microglia costituisce la prima linea di difesa contro i danni del SNC. Le cellule della microglia sono cellule immunocompetenti che mantengono l'omeostasi cerebrale, garantiscono e controllano il trofismo neuronale. In condizioni fisiologiche la microglia a riposo presenta, a livello morfologico, un soma ristretto e lunghe ramificazioni dinamiche, che agiscono da sentinelle del microambiente circostante. In presenza di uno stimolo lesivo, invece, va incontro ad una rapida attivazione con modificazioni sia a livello morfologico che funzionale. Esistono diversi fenotipi di attivazione della microglia: il fenotipo M1 classico, pro-infiammatorio, e il fenotipo M2 alternativo, anti- infiammatorio. Nella malattia di Alzheimer la deposizione del peptide beta-amiloide (Aβ) determina uno stato di infiammazione cronica, che promuove l'attivazione e il reclutamento della microglia. Diversi studi sperimentali hanno dimostrato come il sistema endocannabinoide sia in grado di contrastare il processo neurodegenerativo e quindi avere un ruolo protettivo nella patogenesi della patologia di Alzheimer, aprendo un nuovo scenario su possibili strategie terapeutiche per questa devastante malattia. Questo progetto ha come scopo lo studio dell'influenza di URB597, un ben noto inibitore dell'enzima FAAH, sull’attivazione delle cellule gliali, in particolare sulla morfologia e sul rilascio di mediatori infiammatori in cellule di microglia murina BV-2. A tale scopo, le cellule sono state caratterizzate sia morfologicamente che funzionalmente. Inizialmente è stata valutata la vitalità cellulare per definire la concentrazione di URB597 da usare nei saggi sperimentali, e, una volta definita la concentrazione ottimale, si è proceduto a determinare la vitalità cellulare nelle cellule BV-2 trattate con Aβ in presenza o assenza di URB597. I dati ottenuti hanno mostrato che la stimolazione con la sola Aβ determina una significativa riduzione della vitalità rispetto al controllo, che non viene contrastata da URB597, suggerendo la non citotossicità dell’inibitore. Sono stati esaminati i cambiamenti morfologici, sinonimo di attivazione microgliale, attraverso analisi del citoscheletro di actina mediante microscopia a fluorescenza. I risultati hanno mostrato come URB597 sia in grado di revertire il fenotipo ameboide, tipico dell’attivazione microgliale. Dal momento che la plasticità cellulare è regolata dal citoscheletro di actina attraverso le proteine della famiglia Rho GTPasi, sono stati valutati i livelli di espressione e lo stato di attivazione delle proteine Rho, Rac e Cdc42, mediante analisi di western blot e saggio di pull down. Le analisi dei western blot indicano che i livelli delle proteine Rho, Rac e Cdc42 non presentano nessuna alterazione. Nonostante non siano visibili cambiamenti nei livelli di espressione di queste proteine, è risultata evidente una up-regolazione dell’attività della proteina Cdc42, molecola coinvolta in processi fisiologici come motilità e fagocitosi. Quindi, è stato valutato l’effetto di URB597 nelle cellule BV-2 trattate con o senza Aβ, sulla migrazione e sulla fagocitosi, caratteristiche, rispettivamente, dei fenotipi di attivazione M1 e M2. I risultati ottenuti hanno dimostrato che URB597, quando somministrato insieme ad Aβ, è in grado di ridurre la migrazione e di aumentare il numero di cellule in fagocitosi. Per confermare l'attivazione delle cellule BV-2 dopo l'insulto con Aβ, sono stati condotti esperimenti atti a valutare i marcatori di attivazione microgliale, come Iba1, e i marcatori specifici di polarizzazione M1/M2: iNOS e Arg-1, mediante microscopia a fluorescenza. I risultati hanno mostrato una up-regolazione del marcatore Iba1 sia dopo trattamento con URB597 e Aβ da soli, che nel trattamento combinato, indicando attivazione microgliale. Inoltre, URB597, in trattamento combinato con Aβ, sembra ridurre l’espressione di iNOS inducendo, da solo, quella di Arg-1. Poichè l'attivazione della microglia è accompagnata dal rilascio di citochine pro-infiammatorie, è stata valutata la loro espressione nelle cellule BV-2, trattate come già descritto, mediante analisi di q-PCR. I risultati hanno mostrato che URB597, in trattamento combinato con Aβ, ha ridotto significativamente l’espressione dell’mRNA per le citochine pro- infiammatorie TNF-a e IL-1b, e, da solo, ha aumentato quella per le citochine anti-infiammatorie TGF-b e IL-10. In conclusione, i risultati di questa ricerca hanno dimostrano che, in presenza di un danno al SNC, URB597 è in grado di dirigere la polarizzazione microgliale verso il fenotipo M2 anti-infiammatorio.