Angiogenic role of extracellular vesicles in human platelet lysate

Il principale ruolo delle piastrine è conosciuto in processi quali l’emostasi e la trombosi, ma esse svolgono la loro funzione anche come principali regolatori dell'angiogenesi, costituita da fasi di proliferazione endoteliale, germinazione e neo-angiogenesi1-3. L'angiogenesi è un processo chiave per la rigenerazione dei tessuti e il ruolo emergente delle piastrine nel migliorare l'angiogenesi deriva dalla loro interazione con l'endotelio, ad esempio durante il danno vascolare dove agiscono per preservare l'integrità e l'omeostasi dei vasi 2. Inoltre, le piastrine mostrano un profilo secretorio unico composto da molteplici fattori di crescita, citochine, microRNA, piccole molecole solubili e proteine con un doppio ruolo pro e antiangiogenico 3-5. Questa combinazione equilibrata di mediatori è principalmente contenuta in vescicole extracellulari (EV), oggi concepite come segnalosomi o vettori biologici delle quali le piastrine rappresentano la fonte più abbondante dell’organismo umano 6,7. Le EV possono essere di dimensioni e composizione eterogenee (esosomi, microparticelle, macrovesicle) ed è stato riportato che rispecchiano le proprietà emostatiche delle piastrine8. Il coinvolgimento delle piastrine e delle EV nei processi angiogenici in cellule endoteliali ha incoraggiato una migliore comprensione del loro potenziale terapeutico per applicazioni di tipo rigenerativo in cui il ripristino o il miglioramento dell'angiogenesi rappresenta l’obiettivo clinico da raggiungere9. Di conseguenza anche il preparato clinico conosciuto come lisato piastrinico (LP) è in grado di potenziare e riflettere le proprietà angiogeniche delle piastrine4. La pletora di fattori, molecole solubili ed EV altamente concentrati in questo emoderivato è considerata la principale responsabile della sua capacità angiogenica, ma la modalità con cui l'EV derivate dal LP potrebbero regolare l'angiogenesi deve ancora essere affrontata in modo completo. A tal proposito, lo scopo del mio studio è confermare che LP Mesengen®, (brevetto No.WO2013042095) rappresenta una fonte di EV biodisponibile e quindi validare il ruolo individuale delle EV in relazione alla capacità di mediare l'angiogenesi in cellule endoteliali. Inoltre, vogliamo dimostrare quali meccanismi molecolari ed azioni biologiche mediate dal LP e dalle sole EV derivate dal LP possono contribuire al ripristino dell’ endotelio dopo insulto e quindi aprire una nuova strada sull’impiego del LP come strumento per la rigenerazione vascolare nell’ambito delle cell-free therapy. I risultati ottenuti mostrano che il LP contiene EV, ottenute mediante tecnica di ultracentrifugazione (100000g per 1h) e caratterizzate in base a dimensione, fenotipo e morfologia10. Infatti, grazie all’ausilio di filtri 0,8 e 0,22 m e beads a dimensione nota, l’analisi citofluorimetrica FACS ha dimostrato la presenza di classi di EV eterogenee con diametro di >800 nm, compreso tra 800 nm e 200 nm e < 200 nm. Le EV sono state caratterizzate ulteriormente valutando il loro fenotipo, risultato principalmente positivo per il CD41 (marcatore proteico della membrana piastrinica o glicoproteina IIb, 50,61% ) e un espressione molto bassa del doppio positivo CD41/CD61(canonico marcatore esosomiale, 0,76%) 11,12. L’osservazione morfologica tramite TEM ha rivelato la presenza delle medesime vescicole dimensionalmente eterogenee, a forma tondeggiante ed elettrondense, fattore che indica la presenza di un contenuto vescicolare11. I nostri risultati in vitro, su HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) trattate con EV derivate dal 10%LP per 24h, hanno dimostrato la loro interazione a livello citoplamatico. Inoltre, le diverse filtrazioni del LP, pur non influenzando migrazione e proliferazione, sono in grado di alterare l’attività angiogenica delle cellule endoteliali. In particolar modo abbiamo osservato una diminuzione significativa della capacità di formare loop nel saggio Matrigel (p<0.001) dopo la somministrazione del LP 0,22, contenente quindi EV inferiori a 200nm. Per confermare che le sole EV sono responsabili dell’effetto angiogenico sono state estratte e somministrate alle HUVEC durante il medesimo saggio Matrigel10. I risultati ottenuti hanno dimostrato che le EV 0,22 hanno ridotto significativamente l'effetto angiogenico rispetto al 10% EV (p=0,04), che è stato a sua volta in grado di aumentare il numero di loop rispetto alla condizione senza siero ( EBM p=0,015) , ma ancora in misura minore rispetto al 10% LP (p=0,0198). È interessante notare che, in condizioni di ipossia l’effetto angiogenico è stato conservato in tutte le condizioni. Inoltre, abbiamo corroborato questa osservazione tramite il 3D bioprinting con fibre di idrogel in grado di incorporare le HUVEC sottoposte al trattamento con i diversi terreni EGM-2 (controllo positivo), EBM (controllo negativo), 10%LP, LP 0,8 e LP 0,22. È stato quindi dimostrato che le strutture simili a vasi, risultanti dal 3D bioprinting, presentano una percentuale maggiore dell'area endoteliale CD31+/vWF + nei trattamento 10%LP rispetto a LP 0,22 (p=0,0382). Inoltre il mezzo condizionato con LP 0,8 e LP 0,22 diminuisce significativamente i livelli di perossido di idrogeno (H2O2) rispetto a 10% LP. Poiché Nox4 è considerato la principale e specifica isoforma NADPH responsabile della produzione diretta di H2O2 nelle cellule endoteliali13,14, abbiamo studiato il suo potenziale coinvolgimento, notando che LP 0,22 è in grado di migliorare i livelli di mRNA Nox4 rispetto al 10% LP (p=0,0021) . Il condizionamento ipossico è stato in grado di equalizzare i livelli espressione di Nox4 in tutte le condizioni (p>0,05 tutto ). A questo punto, abbiamo nuovamente trattato le colture direttamente con le EV ultracentrifugate e i risultati hanno mostrato che l'intero pool del 10%EV ha ridotto i livelli di mRNA di Nox4 rispetto al 10% LP (p=0,04), ma la rimozione della frazione di EV>200nm dall'intero pool di EV non ha modificato questo scenario, suggerendo che l'intero pool di vescicole probabilmente contribuisce alla modulazione di Nox4. È interessante notare che l' ipossia ha ribaltato questo scenario, appiattendo queste differenze tra le condizioni (p>0,05 tutte). Inoltre, data la presenza in letteratura di studi sulla funzionalità piastrinica mediata da microRNA e il loro trasporto correlato a funzioni vescicolari, abbiamo analizzato, per la prima volta, il miRNoma del LP tramite RNA Seq. Ne è risultato un contenuto di RNA, rappresentato da miRNA (43%), seguito da Y RNA (17%), RNA antisenso (10%) e lincRNA (8 %). Successive analisi in silico, ci hanno permesso di selezionare miRNA altamente espressi e coerenti tra i 4 replicati di LP analizzati e di correrali, grazie a database di ontologia genica, a miRNA noti coinvolti nell’ attivazione endoteliale, nella vasculogenesi e nell’ossidazione NADPH . Cosi da ottenere una lista di 5 miRNA: miR-320a; miR-148b-3p; miR-25-3p; miR-26b-5p; miR-152-3p. Inoltre, abbiamo scoperto che miR126 , noto anche come angiomiRNA ed espresso selettivamente sulle cellule endoteliali15, era tra i primi 40 miRNA espressi nel LP. Di conseguenza, abbiamo validato la sua presenza nel nostro LP riscontrando livelli di miR 126 tramite Real Time PCR che aumentano in modo proporzionale alla quantità di LP testato (p=0,043). In conclusione possiamo affermare che il LP Mesengen contiene EV di origine pistrinica con dimensioni differenti ed eterogenee che possiedono attività angiogeniche. Il nostro LP è in grado di modulare lo stato ossidativo di cellule endoteliali attraverso l’interazione con il pathway della Nox4. Importanti analisi di Small RNA seq hanno fatto emergere la presenza nel LP di miRNA, espressi in modo omogeneo, verosimilmente correlati a funzioni endoteliale, vascolari e stato ossidativo NADPH. Abbreviazioni LP= Lisato piastrinico; EV= vescicole extracellulari; LP 0,8= lisato piastrinico al 10% filtrato 0,8 m; LP 0,22= lisato piastrinico al 10% filtrato 0,22 m; EV 0,8= vescicole extracellulari al 10% filtrate 0,8 m; EV 0,22= vescicole extracellulari filtrate 0,22 m.