Meccanismi molecolari e cellulari che coinvolgono i rafts lipidici e la proteina prionica cellulare nel processo di differenziamento neuronale

Sono stati condotti studi sul signaling molecolare che sottende i processi differenziativi neuronali, utilizzando come modello sperimentale cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentaria umana (hDPSCs). Infatti, ancora oggi non sono stati completamente chiariti i meccanismi di attivazione delle vie che portano la cellula staminale a differenziare, così come poco conosciuto risulta essere il ruolo di particolari strutture chiamate rafts lipidici. Sulla base della letteratura medica, inoltre, interessante risulta essere il ruolo svolto da un particolare componente dei rafts lipidici, la Proteina Prionica Cellulare (PrPC), la cui espressione viene modulata a seconda del grado di differenziamento della cellula staminale e che sembra essere coinvolta nel signaling molecolare del processo di differenziamento neuronale. Il disegno sperimentale è stato articolato nelle seguenti fasi: - Studio dei rafts lipidici mediante l’utilizzo di sostanze che interferiscono con i rafts lipidici, quali PDMP, inibitore competitivo della glucosilceramide sintetasi che blocca la sintesi dei gangliosidi arrestando la formazione dei rafts lpidici,) e MβCD (induttore di efflusso di colesterolo dalla membrana con conseguente scompaginamento dei microdomini; - Valutazione delle vie di segnalazione che si attivano o inattivano in risposta a stimoli neuroinduttivi; - Ruolo della PrPC nel processo differenziativo neuronale delle hDPSCs. Dopo aver richiesto ed ottenuto l’approvazione del Comitato Etico dell'Azienda Policlinico Umberto I (Rif. CE:4336), le cellule sono state isolate seguendo una specifica procedura. In seguito, è stata effettuata una caratterizzazione preliminare delle hDPSCs che ha dimostrato come tali cellule soddisfino i requisiti indicati nelle linee guida della Società Internazionale per le Terapie Cellulari (ISCT). Infatti, le hDPSCs coltivate in vitro presentano adesione alla plastica in condizioni di coltura standard ed esprimono antigeni di superficie caratteristici delle cellule staminali mesenchimali. Inoltre, le hDPSCs sono in grado di differenziare in cellule della linea neuronale dopo coltura in terreni addizionati con specifici supplementi e fattori di crescita. Dal momento che in letteratura è documentato il coinvolgimento dei gangliosidi nel differenziamento neuronale, è stata effettuata anche la caratterizzazione lipidica delle hDPSCs di controllo e neuroindotte. I risultati ottenuti, che confermano ed estendono gli studi precedenti, mostrano come il GD1a ed il GM3 siano presenti sia prima sia dopo neuroinduzione. Al contrario, il GM2 è esclusivamente espresso dalle staminali di controllo mentre il GD3 è espresso nelle neuroindotte. Inoltre, dall’analisi in immunofluorescenza, la distribuzione del segnale delle molecole gangliosidiche sulla membrana plasmatica è risultata essere non uniforme, fatto questo che indica la presenza di microdomini di membrana arricchiti in GM2 nelle hDPSCs di controllo e GD3 nelle hDPSCs neuroindotte. E’ stata quindi indagata la distribuzione dei gangliosidi nei microdomini, in quanto componenti chiave costitutivi dei rafts lipidici, nonché porzioni specializzate di membrana plasmatica cellulare che servono a concentrare i recettori specifici di membrana e che forniscono anche un’ancora per le proteine ​​di trasduzione del segnale. Dalle indagini è risultato che il GM2 è arricchito nelle frazioni 4, 5 e 6, corrispondenti ai rafts lipidici. Inoltre, è stata condotta l’analisi in immunoblot della distribuzione di EGF-R, la quale ha mostrato che anche tale recettore è presente principalmente nelle frazioni 4, 5 e 6. In letteratura sono riportati risultati discordanti sulla presenza di EGF-R all’interno dei rafts lipidici; tale presenza può infatti dipendere dal tipo di cellula, dall'uso di diversi detergenti e dalla composizione in gangliosidi delle cellule stesse. Al fine di dimostrare che la deplezione del ganglioside inibisce il differenziamento neuronale delle hDPSCs indotto da EGF/bFGF, sono state analizzate cellule pretrattate con [D]-PDMP, inibitore competitivo della glucosilceramide sintetasi che blocca la sintesi dei gangliosidi arrestando la formazione dei rafts lipidici. Come evidenziato dai dati sperimentali, dopo pretrattamento con [D]-PDMP e successivo stimolo con EGF/bFGF, l’espressione gli antigeni neuronali β3-tubulina, NFH e GAP43 risultano notevolmente ridotti. Risultati del tutto analoghi sono stati ottenuti su cellule non trattate o pretrattate con MβCD, un composto che è in grado di indurre un particolare efflusso di colesterolo dalla membrana inibendo in tal modo i rafts lipidici. Inoltre, partendo dall’assunto che sia Erk 1/2 sia Akt siano coinvolti nella differenziazione neuronale delle cellule staminali embrionali e che il trattamento con EGF aumenti la fosforilazione di ERK e AKT, è stato indagato il ruolo dei rafts lipidici nella fosforilazione di queste proteinchinasi. Utilizzando specifici anticorpi, anti-fosfo ERK 1/2 (p-ERK1/2) e anti-fosfo Akt (p-Akt), è stato possibile osservare che il trattamento con EGF aumenta significativamente i livelli di fosforilazione di Erk 1/2 ed Akt mentre tale fosforilazione, in entrambe le proteinchinasi, diminuisce nettamente in campioni pretrattati con [D]-PDMP. Risultati del tutto simili sono stati trovati dopo pretrattamento delle hDPSCs con MβCD. I dati, nel loro insieme, indicano che tutti i principali componenti costitutivi dei rafts lipidici, siano essenziali per il ruolo che i rafts stessi svolgono nel differenziamento cellulare, suggerendo quindi che queste porzioni specializzate di membrana possano rappresentare siti specifici dove complessi pathway multimolecolari di segnalazione, tra cui lipidi (gangliosidi, colesterolo) e proteine ​​(EGF-R), svolgono un ruolo chiave nella differenziazione neuronale di hDPSCs. Come documentato in letteratura, tra le diverse proteine localizzate all’interno dei rafts lipidici vi è la PrPC, inserita nella superficie cellulare mediante un’ancora costituita da glicosilfosfatidilinositolo (GPI). Recenti studi riportano come l’espressione della PrPC sia modulata a seconda del grado di differenziamento della cellula staminale e documentano come tale proteina sia coinvolta nel signaling molecolare del processo differenziativo neuronale di cellule progenitrici. Dunque, sulla base dell’ipotesi che la PrPC possa avere un ruolo anche nel processo differenziativo neuronale delle cellule staminali mesenchimali, è stata verificata l’espressione della proteina nelle hDPSCs sia di controllo sia neuroindotte. Già nelle staminali a 21 gg dalla separazione della polpa è stato possibile rilevare la presenza della PrPC, divenuta più marcata a 28 gg, per raggiungere significative percentuali di espressione dopo neuroinduzione. Ad ulteriore conferma dei dati ottenuti in citofluorimetria, è stato eseguito sia un Immunoblot sia una Immunomfluorescenza su cellule di controllo e neuroindotte, utilizzando in entrambi i casi l’anticorpo anti-Prp. Poiché in letteratura è documentato che la PrPC è associata ai gangliosidi all'interno dei rafts lipidici, è stata verificata la sussistenza di tale associazione anche nelle hDPSCs. E’ stato osservato come il GM2 associ con la PrPC nei campioni di controllo ma non nei neuroindotti mentre il GD3 associ con la PrPC nei campioni neuroindotti ma non in quelli di controllo. E’ stato inoltre verificato come l’EGF-R, invece, associ con la PrPC nei campioni di controllo e, ancora più marcatamente, nei campioni neuroindotti. D'altra parte, è stato dimostrato che il recettore EGF è il componente di un complesso di segnalazione, locato all'interno dei microdomini, coinvolto in diverse funzioni di cellule di neuroblastoma (N2a); questi dati, inoltre, indicano che la PrPC fa parte dei complessi di membrana che regolano la segnalazione di EGF/EGF-R. Sulla base di queste evidenze, dunque, è stato ipotizzato che, dopo l'induzione neuronale, l’EGF-R sia reclutato all'interno dei rafts lipidici dove, interagendo con la PrPC, inneschi la trasduzione del segnale. Infatti, i rafts lipidici sono strutture in grado di concentrare recettori specifici, coinvolti nell'avvio della trasduzione del segnale, sulla membrana plasmatica. E’ stato quindi indagato se, durante la differenziazione neuronale delle hDPSCs, la PrPC fosse in grado di regolare le vie di trasduzione del segnale indotte dall’EGF/EGF-R. Infatti, come riportato da altri autori, la PrPC è in grado di regolare l'attivazione di MAP chinasi e Protein Kinase B mediante la modulazione di EGF-R nelle cellule N2a e SK-N-SH. In questo contesto è stato ipotizzato che, nelle hDPSCs, la PrPC possa essere in grado di regolare l'attivazione di ERK 1/2 e Akt. In effetti, come emerso dai dati sperimentali, il pretrattamento con siRNA PrP per 72 ore ha comportato una riduzione dell'attivazione di ERK 1/2 e Akt indotta da EGF. Dunque, nel modello cellulare preso in esame, è stato dimostrato che l'attivazione delle protein chinasi (ERK 1/2 e Akt) è stata mediata dalla PrPC e che l'associazione con l’EGF-R è aumentata dopo l'induzione neuronale. Poiché alcuni autori hanno evidenziato il ruolo della PrPC durante il processo di differenziazione cellulare e, in particolare, il contributo della PrPC all'acquisizione del fenotipo neuronale modulando l'attività dell'integrina β1, è stato indagato il ruolo della PrPC nel processo di differenziazione neuronale delle hDPSCs. A tale scopo è stato silenziato il gene PRNP in modo da ridurre drasticamente l’espressione della PrPC; questo processo ha influenzato il differenziamento neuronale delle hDPSCs, come mostrato dalla netta riduzione dell’espressione dei marcatori neuronali testati su hDPSCs neuroindotte e pretrattate con siRNA PrP. Nel loro insieme, i dati indicano che la PrPC sia espressa nelle hDPSCs non trattate e che tale espressione aumenti nel corso della neuroinduzione, per raggiungere il picco nelle hDPSCs neuroindotte. Inoltre, è stato dimostrato come la PrPC regoli il signal pathway indotto da EGF/EGF-R durante il differenziamento neuronale delle hDPSCs e che il silenziamento del gene PRNP porti ad una mancata espressione dei tipici marcatori neuronali. Concludendo, dunque, è possibile affermare che: l’integrità dei rafts lipidici è essenziale nel processo differenziativo neuronale delle hDPSCs; la PrPC interagisce, all’interno dei rafts lipidici, con l’EGF-R, giocando un ruolo chiave nel complesso di segnali multimolecolari coinvolti nel differenziamento neuronale delle hDPSCs. Il coinvolgimento della PrPC nel processo differenziativo neuronale delle cellule staminali risulta di grande interesse, poiché apre alla possibilità di applicazioni pratiche nell’ambito delle neuropatologie degenerative (e.g. Alzheimer, Parkinson, Sclerosi multipla) in quanto possibile target molecolare per la rigenerazione del tessuto nervoso.