Malattie da mutazioni dei tRNA mitocondriali: implementazione di strategie terapeutiche e modelli cellulari innovativi

INTRODUZIONE E SCOPO DELLO STUDIO Le malattie mitocondriali sono patologie multisistemiche associate a mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) e/o nucleare. La maggior parte delle mutazioni patogene a carico del mtDNA sono localizzate su geni dei tRNA (mt-tRNA) e causano quadri patologici complessi con coinvolgimento di singoli organi (es. cardiomiopatie) o di organi multipli (miopatie, encefalopatie). Ad oggi non è stata identificata alcuna terapia efficace per queste malattie e ciò appare riconducibile a due ordini di problemi; da un lato la mancanza di modelli animali in grado di riprodurre le mutazioni del mtDNA e dall’altro la difficoltà di veicolare molecole potenzialmente terapeutiche nei mitocondri. Studi condotti nel nostro laboratorio hanno recentemente dimostrato come il peptide β32-33 derivato dalla porzione carbossi-terminale (Cterm) della leucil-tRNA sintetasi mitocondriale (LeuRS) sia in grado di migliorare il fenotipo patologico associato alle mutazioni a carico di diversi mt-tRNA. L’analisi in vitro delle interazioni tra il peptide e i tRNA sintetici suggerisce che l’effetto terapeutico non sia correlabile all’azione catalitica ma a un’attività chaperonica che comporta una stabilizzazione del tRNA. Questo dato è in linea con il fatto che il peptide derivi dalla porzione non catalitica dell’intero enzima e trova conferma nell’effetto di rescue anche nei confronti di mutazioni su tRNA non cognati. I cibridi transmitocondriali (cibridi) ad oggi rappresentano il modello cellulare più utilizzato nello studio delle malattie mitocondriali; tuttavia derivando da cloni neoplastici non sono in grado di ricapitolare la tessuto-specificità del danno da mutazioni del mtDNA. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ha aperto a nuove strategie rivoluzionando il campo dei modelli cellulari utilizzati nella ricerca biomedica. Lo scopo del mio dottorato è stato quello di avvicinare all’applicazione terapeutica la molecola peptidica, da noi precedentemente identificata, con il seguente approccio: i.) Sviluppo di strategie per veicolare le molecole in studio alla matrice mitocondriale. ii.) Analisi dell’effetto tessuto-specifico delle mutazioni dei mt-tRNA ed individuazione di eventuali meccanismi terapeutici dotati di specificità tissutale. MATERIALI E METODI Per testare le molecole oggetto della prima parte dello studio, abbiamo utilizzato cibridi che derivano dalla fusione di cellule di osteosarcoma private del proprio mtDNA con fibroblasti enucleati provenienti da soggetti di controllo (mtDNA wild-type) e da pazienti portatori della mutazione m.3243A>G a carico del tRNALeu(UUR) che causa la sindrome MELAS (Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis, and Stroke-like episodes; cibridi MELAS). Abbiamo quindi valutato il fenotipo patologico (vitalità cellulare e consumo di ossigeno) dei cibridi mutanti prima e dopo il trattamento con il peptide inserito in diversi costrutti disegnati per facilitarne l’accesso alla matrice mitocondriale. Il secondo obiettivo di questo progetto è stato lo sviluppo di modelli cellulari adeguati allo studio dell’effetto tessuto-specifico delle mutazioni dei mt-tRNA. Nel corso del mio dottorato abbiamo sviluppato cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) a partire da fibroblasti MELAS con percentuali variabili di eteroplasmia (percentuale di molecole di mtDNA mutato) e di soggetti di controllo (WT), differenziando le colonie ottenute in cellule neuronali staminali, che mantengono i diversi livelli di eteroplasmia. RISULTATI E DISCUSSIONE I. Sviluppo di strategie per veicolare le molecole in studio alla matrice mitocondriale Abbiamo disegnato e testato i seguenti 5 costrutti che hanno mostrato una co-localizzazione mitocondriale in assenza di tossicità cellulare: 1. FRFK-β32_33-FITC (Fβ): composto da un piccolo oligomero sintetico in grado di penetrare le membrane cellulari e mitocondriali (FRFK) e dalla sequenza β32_33; 2. FRFK-scramble-FITC (FS): composto da FRFK e dalla sequenza β32_33 variata nell’ordine dei residui amminoacidici; 3. FRFK-β32_33 (noKKR)-FITC (FA): un composto in cui i tre residui carichi positivamente (K-K-R) della sequenza β32_33 vengono sostituiti da residui neutri di alanina (A); 4. β32_33-FITC (β): composto dalla sola sequenza β32_33; 5. FRFK-FITC (F): composto dalla sola presequenza FRFK da utilizzare come controllo negativo. Abbiamo successivamente valutato l’effetto dei peptidi sulla vitalità cellulare e sul consumo di ossigeno dei cibridi dimostrando come esclusivamente il costrutto Fβ fosse in grado di migliorare il fenotipo dei cibridi MELAS. Un dato interessante è che né FS né FA siano in grado di migliorare il difetto biochimico dei cibridi; questo risultato permette di ipotizzare come la funzione del peptide β32_33 dipenda sia dall’ordine dei residui amminoacidici che dal numero delle cariche positive. Stante la prospettiva futura di veicolare nelle cellule le molecole terapeutiche oggetto del nostro studio, abbiamo parallelamente iniziato la ricerca di un ipotetico carrier, focalizzando la nostra attenzione sulla ferritina umana. La molecola di ferritina è stata coniugata al frammento β32_33 sia in presenza che in assenza di una sequenza di escape lisosomiale (RLA), non mostrando tuttavia in nessuna di queste condizioni una localizzazione mitocondriale. Per favorirne la localizzazione mitocondriale la ferritina è stata quindi fusa a una molecola di targeting mitocondriale MTS (Cox8A) che, tuttavia, ad oggi non siamo riusciti ancora ad esprimere nei ceppi di E. Coli. II. Analisi dell’effetto tessuto-specifico delle mutazioni dei mt-tRNA ed individuazione di eventuali meccanismi terapeutici dotati di specificità tissutale Per la produzione di iPSCs abbiamo selezionato fibroblasti di pazienti con sindrome MELAS con una percentuale di eteroplasmia pari a circa il 50% ottenendo, dopo 30 giorni, colonie mature che mostravano positività al marcatore di staminalità TRA 1-60. Dopo l’espansione abbiamo ottenuto 12 colonie di cui 7 costituite da cellule staminali pluripotenti, identificate attraverso pCR. Dopo averne verificato i livelli di eteroplasmia (compresi tra il 7% e il 77%), per gli studi successivi di differenziamento abbiamo deciso di utilizzare la colonia con la percentuale maggiore (77%, iMS-4) e quella con la percentuale minore (7%, iMS-1) da utilizzare come controllo isogenico. Tali colonie sono state inoculate in topi immunodepressi portando allo sviluppo di teratomi. Una volta caratterizzate nel dettaglio le colonie, abbiamo iniziato il differenziamento delle iPSCs in neuroni ottenendo inizialmente cloni di cellule staminali neurali (NSCs, dato confermato dalla positività per diversi markers neurali). Ad oggi è in corso il differenziamento di tali cellule in neuroni. Gli studi successivi saranno incentrati sull’analisi dettagliata del fenotipo di questi nuovi modelli cellulari e sullo studio dell’effetto tessuto-specifico dei nostri costrutti.