La sindrome di Klinefelter descritta per la prima volta nel 1942 da Harry F. Klinefelter, è una malattia genetica, che colpisce gli individui di sesso maschile, caratterizzata da alta statura, proporzioni del corpo eunucoide, incompleto sviluppo dei caratteri sessuali maschili primari e secondari, ginecomastia, testicoli dalle dimensioni ridotte, azoospermia ed aumento dei livelli ormonali di FSH. La sindrome è causata da un aneuploidia congenita dei cromosomi sessuali e nell’80% i pazienti presentano il cariotipo 47, XXY mentre i restanti casi hanno un più alto grado di aneuploidie, mosaicismo o strutture anormali del cromosoma X (Lanfranco et al., 2004). La prevalenza della sindrome di Klinefelter (KS) è compresa tra 1/500 e 1/1000 e viene considerata la principale causa genetica di infertilità maschile (Bojesen et al., 2003), responsabile del 10-15% delle oligospermie severe e azoospermie non ostruttive. Nei soggetti KS si verifica, infatti, la degenerazione dei tubuli seminiferi che inizia prima della pubertà e porta, nella maggior parte dei casi, alla completa ialinizzazione dei tubuli seminiferi nell’adulto, anche se in alcuni soggetti KS adulti possono essere presenti alcuni tubuli funzionali (Aksglaede et al 2006). Sebbene la maggioranza dei soggetti KS siano azoospermici e quindi sterili, sono stati descritti, in letteratura casi di oligozoospermia severa e criptozospermia in pazienti di età inferiore ai 24 anni (Forti et al, 2006). Diversamente dalle trisomie autosomiche che hanno un’origine paterna soltanto nel 10% dei casi, il cromosoma X soprannumerario dei pazienti KS origina nel 50% dei casi da una non disgiunzione paterna (Thomas and Hassold, 2003). L’ XXY di origine materna può essere causato da una non-disgiunzione durante la prima e la seconda divisione meiotica oppure durante le divisioni mitotiche precoci post zigotiche mentre si verifica lo sviluppo dello zigote. L’ XXY paterno invece, origina soltanto da errori durante la meiosi I; la non disgiunzione paterna durante la meiosis II porterebbe infatti alla formazione di zigoti XXX e XYY ( Lanfranco et al, 2004) La grande maggioranza dei casi Klinefelter con origine paterna deriva quindi da eventi di non disgiunzione durante la meiosi I, anche se sono stati descritti casi di separazione prematura dei cromatidi fratelli durante la meosi I. (Tüttelmann et al 2010) E’ stato ipotizzato che le delezioni e i riarrangiamenti del cromosoma Y potessero avere un ruolo nel mancato appaiamento dei cromosomi e indurre una maggiore frequenza degli eventi di non disgiunzione (Rajpert et al.,2011). In accordo con questa ipotesi è stato dimostrato che la microdelezione della regione AZFc (b2/b4) è associata con elevata percentuale di spermatozoi nullisomici e con disomia XY e conseguente rischio dopo ICSI della nascita di bambini 47XXY (Ferlin et al.,2007). Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano la causa genetica più frequente di infertilità maschile, con una prevalenza del 10-15% tra i soggetti affetti da azoospermia non ostruttiva o grave oligozoospermia (<5mil sperm/ml) (Foresta et al., 2001). Molto raramente si riscontrano microdelezioni nei soggetti con numero di spermatozoi >5mil sperm/ml e mai nei soggetti normozoospermici. Diversi studi hanno indagato l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y nei pazienti KS. Alcuni autori hanno rilevato un’associazione tra le microdelezioni del cromosoma Y e la sindrome KS, (Mitra et al., 2006; Hadjkacem-Loukil et al., 2009; Ceylan et al., 2010, Li et al., 2015) mentre altri appaiono in contrasto con questo dato, non evidenziando alcuna associazione tra le due alterazioni genetiche (Tateno et al., 1999; Lee et al., 2000; Ambasudhan et al., 2003; Choe et al., 2007; Balkan et al., 2008; Behulova et al., 2011, Simoni et al 2008, Rajpert-De Meyts et al. 2011, Zhang et al 2013) Altro aspetto molecolare importante è l’inattivazione di uno dei due cromosomi X durante lo sviluppo in questi pazienti. In questi pazienti circa il 15% dei geni del cromosoma X sfugge alla normale inattivazione epigenetica inducendo una overespressione genica. Tale modificazione epigenetica potrebbe essere considerata la base genetica del fenotipo del Klinefelter. (Berletch et al.,2010). La grande variabilità fenotipica che si verifica in pazienti con sindrome di Klinefelter, infatti, può essere causata da diversi fattori quali polimorfismi genetici o effetti epigenetici che possono influenzare l’inattivazione del cromosoma X. Si può ipotizzare, quindi, che il fenotipo dei pz con Sindrome di Klinefelter potrebbe essere influenzato da: 1- un eccessivo dosaggio dei geni legati al cromosoma X causato da una alterata inattivazione genica (Carrel et al., 2005). 2- diverso grado di mosaicismo 46,XY 3- origine parentale del cromosoma X soprannumerario (Iitsuka et al.,2001) 4- funzione alterata dei geni che codificano per gli androgeni in quanto livelli subnormali portano a difetti di sviluppo testicolare (Lahlou et al., 2004). Per quanto riguarda l’ipotesi della modificazione dell’inattivazione genica è da sottolineare che alcuni autori hanno evidenziato che l’inattivazione casuale di una delle due X potrebbe mascherare il fenotipo derivante da mutazioni recessive collegate al cromosoma X (Iitsuka et al.,2001, Yoshioka et al.,1998). Nei mammiferi con più di un cromosoma X, i geni di uno dei due cromosomi X non vengono espressi: questo fenomeno è noto come inattivazione del cromosoma X e si verifica nei maschi XXY così come nelle normali femmine XX (Chow JC et al., 2005). L'inattivazione del cromosoma X è un processo biologico che consiste nella disattivazione (perdita di funzione) di uno dei due cromosomi sessuali X presenti nelle loro cellule. Tale cromosoma viene "silenziato", ovvero reso inerte dal punto di vista trascrizionale, tramite impacchettamento in un'unità densa di eterocromatina a formare una struttura inerte definita corpo di Barr; il risultato di tale processo è un'attenuata espressione, in tutte le cellule, dei geni portati dai cromosomi X, e dei fenotipi da essi manifestati. Il gene deputato a tale processo è XIST (X inactive specific transcript), che trascrive un RNA espresso solo dal cromosoma inattivato e che non codifica per alcuna proteina. Agisce sul centro di inattivazione dell'X (Xic, X inactivation center) e non è espresso nel maschio con cariotipo normale (46, XY). Ognuno dei due cromosomi X dei maschi con sindrome di Klinefelter hanno la medesima probabilità di venire attivati, ma non tutti i geni vengono silenziati: il 15% rimane in duplice copia biallelica (Aksglaede et al., 2006; Wikström et al .,2004) e si ipotizza che la iperespressione di questi geni sia responsabile del fenotipo della sindrome. In particolare il gene del recettore degli androgeni (AR), membro della super famiglia dei recettori nucleari, è regolato dai livelli di testosterone ed è oggetto di diversi studi genetici. Il gene AR è localizzato sul cromosoma X in posizione Xq11-12, codifica per un fattore di trascrizione ligando dipendente, e contiene una sequenza ripetuta polimorfica CAG nell’esone 1 codificante un tratto di poli-glutammina. L’estrema variabilità del numero delle ripetizioni determina la differente lunghezza del tratto nel dominio di trans-attivazione N-terminale (Zinn et al., 2005; Tirabassi et al., 2013; Francomano et al., 2013). Il numero di ripetizioni CAG può variare da 9 a 36 con variazioni tra le differenti etnie e gruppi razziali; infatti negli uomini caucasici sono presenti in media 21 ripetizioni, negli afro-Americani 18 e negli uomini asiatici 22 ripetizioni (Edwards et al., 1992). (Tirabassi et al., 2015). Nella donna quando il processo di inattivazione della X non avviene correttamente, può verificarsi l’inattivazione non randomica degli alleli per il recettore degli androgeni (AR) con conseguente aumento dell’attività degli androgeni e irsutismo e ovaie policistiche (Calvo et al.,2000; Vottero et al., 1999). Mutazioni del gene nell’uomo sono associate a vari disordini tra cui la sindrome dell’insensibilità completa agli androgeni (Sills et al.,2002), disturbi dei neuroni motori e cancro della prostata (MacLean et al.,1995). È stata dimostrata una relazione inversa tra il numero di ripetizioni nel tratto CAG e la trascrizione della proteina AR: sequenza più lunghe sono associate a una ridotta capacità trascrizionale con conseguente riduzione del meccanismo del feedback androgeno dipendente (Bogaert et al., 2009). Diversi possono essere i target sotto il controllo del recettore degli androgeni in uomini eugonadici: dimensione della prostata (Giovannucci et al.,1999), concentrazione dei lipidi, dell’insulina e della leptina (Zitzmann et al., 2003), funzioni endoteliali (Zitzmann et al.,2001), densità dell’osso (Zitzmann et al., 2001; Chen et al., 2003), sviluppo cognitivo (Seidman et al., 2001; Harkonen et al., 2003) e concentrazione degli spermatozoi (Von Eckardstein et al.,2001). Il rischio di insorgenza del cancro alla prostata risulta aumentato in pazienti con ripetizioni più corte (Ntais et al., 2003). Alla luce di tutto ciò scopo della mia tesi è stato quello di svolgere uno studio molecolare su pazienti affetti da Sindrome di Klinefelter, ed in particolare: 1- STUDIO 1 - identificare l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y in pazienti con Sindome di Klinefelter nella popolazione caucasica al fine di determinare se tale delezione possa aumentare il rischio di aneuploidie cromosomiche e possa avere un impatto nella gestione e nello screening genetico di questi pazienti. Al fine di valutare l’entità di tale alterazione genica nei KS abbiamo confrontato l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y in pazienti KS rispetto ai pazienti con azoospermia non ostruttiva (NOA). 2- STUDIO 2 – analizzare la lunghezza delle ripetizioni CAG e se la variazione di tale polimorfismo possa influenzare il diverso fenotipo in tale sindrome

Aspetti molecolari della sindrome d Klinefelter: studio delle microdelezioni del cromosoma Y e polimorfismi del recettore degli androgeni / Sciarra, Francesca. - (2018 Dec 12).

Aspetti molecolari della sindrome d Klinefelter: studio delle microdelezioni del cromosoma Y e polimorfismi del recettore degli androgeni

SCIARRA, FRANCESCA
12/12/2018

Abstract

La sindrome di Klinefelter descritta per la prima volta nel 1942 da Harry F. Klinefelter, è una malattia genetica, che colpisce gli individui di sesso maschile, caratterizzata da alta statura, proporzioni del corpo eunucoide, incompleto sviluppo dei caratteri sessuali maschili primari e secondari, ginecomastia, testicoli dalle dimensioni ridotte, azoospermia ed aumento dei livelli ormonali di FSH. La sindrome è causata da un aneuploidia congenita dei cromosomi sessuali e nell’80% i pazienti presentano il cariotipo 47, XXY mentre i restanti casi hanno un più alto grado di aneuploidie, mosaicismo o strutture anormali del cromosoma X (Lanfranco et al., 2004). La prevalenza della sindrome di Klinefelter (KS) è compresa tra 1/500 e 1/1000 e viene considerata la principale causa genetica di infertilità maschile (Bojesen et al., 2003), responsabile del 10-15% delle oligospermie severe e azoospermie non ostruttive. Nei soggetti KS si verifica, infatti, la degenerazione dei tubuli seminiferi che inizia prima della pubertà e porta, nella maggior parte dei casi, alla completa ialinizzazione dei tubuli seminiferi nell’adulto, anche se in alcuni soggetti KS adulti possono essere presenti alcuni tubuli funzionali (Aksglaede et al 2006). Sebbene la maggioranza dei soggetti KS siano azoospermici e quindi sterili, sono stati descritti, in letteratura casi di oligozoospermia severa e criptozospermia in pazienti di età inferiore ai 24 anni (Forti et al, 2006). Diversamente dalle trisomie autosomiche che hanno un’origine paterna soltanto nel 10% dei casi, il cromosoma X soprannumerario dei pazienti KS origina nel 50% dei casi da una non disgiunzione paterna (Thomas and Hassold, 2003). L’ XXY di origine materna può essere causato da una non-disgiunzione durante la prima e la seconda divisione meiotica oppure durante le divisioni mitotiche precoci post zigotiche mentre si verifica lo sviluppo dello zigote. L’ XXY paterno invece, origina soltanto da errori durante la meiosi I; la non disgiunzione paterna durante la meiosis II porterebbe infatti alla formazione di zigoti XXX e XYY ( Lanfranco et al, 2004) La grande maggioranza dei casi Klinefelter con origine paterna deriva quindi da eventi di non disgiunzione durante la meiosi I, anche se sono stati descritti casi di separazione prematura dei cromatidi fratelli durante la meosi I. (Tüttelmann et al 2010) E’ stato ipotizzato che le delezioni e i riarrangiamenti del cromosoma Y potessero avere un ruolo nel mancato appaiamento dei cromosomi e indurre una maggiore frequenza degli eventi di non disgiunzione (Rajpert et al.,2011). In accordo con questa ipotesi è stato dimostrato che la microdelezione della regione AZFc (b2/b4) è associata con elevata percentuale di spermatozoi nullisomici e con disomia XY e conseguente rischio dopo ICSI della nascita di bambini 47XXY (Ferlin et al.,2007). Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano la causa genetica più frequente di infertilità maschile, con una prevalenza del 10-15% tra i soggetti affetti da azoospermia non ostruttiva o grave oligozoospermia (<5mil sperm/ml) (Foresta et al., 2001). Molto raramente si riscontrano microdelezioni nei soggetti con numero di spermatozoi >5mil sperm/ml e mai nei soggetti normozoospermici. Diversi studi hanno indagato l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y nei pazienti KS. Alcuni autori hanno rilevato un’associazione tra le microdelezioni del cromosoma Y e la sindrome KS, (Mitra et al., 2006; Hadjkacem-Loukil et al., 2009; Ceylan et al., 2010, Li et al., 2015) mentre altri appaiono in contrasto con questo dato, non evidenziando alcuna associazione tra le due alterazioni genetiche (Tateno et al., 1999; Lee et al., 2000; Ambasudhan et al., 2003; Choe et al., 2007; Balkan et al., 2008; Behulova et al., 2011, Simoni et al 2008, Rajpert-De Meyts et al. 2011, Zhang et al 2013) Altro aspetto molecolare importante è l’inattivazione di uno dei due cromosomi X durante lo sviluppo in questi pazienti. In questi pazienti circa il 15% dei geni del cromosoma X sfugge alla normale inattivazione epigenetica inducendo una overespressione genica. Tale modificazione epigenetica potrebbe essere considerata la base genetica del fenotipo del Klinefelter. (Berletch et al.,2010). La grande variabilità fenotipica che si verifica in pazienti con sindrome di Klinefelter, infatti, può essere causata da diversi fattori quali polimorfismi genetici o effetti epigenetici che possono influenzare l’inattivazione del cromosoma X. Si può ipotizzare, quindi, che il fenotipo dei pz con Sindrome di Klinefelter potrebbe essere influenzato da: 1- un eccessivo dosaggio dei geni legati al cromosoma X causato da una alterata inattivazione genica (Carrel et al., 2005). 2- diverso grado di mosaicismo 46,XY 3- origine parentale del cromosoma X soprannumerario (Iitsuka et al.,2001) 4- funzione alterata dei geni che codificano per gli androgeni in quanto livelli subnormali portano a difetti di sviluppo testicolare (Lahlou et al., 2004). Per quanto riguarda l’ipotesi della modificazione dell’inattivazione genica è da sottolineare che alcuni autori hanno evidenziato che l’inattivazione casuale di una delle due X potrebbe mascherare il fenotipo derivante da mutazioni recessive collegate al cromosoma X (Iitsuka et al.,2001, Yoshioka et al.,1998). Nei mammiferi con più di un cromosoma X, i geni di uno dei due cromosomi X non vengono espressi: questo fenomeno è noto come inattivazione del cromosoma X e si verifica nei maschi XXY così come nelle normali femmine XX (Chow JC et al., 2005). L'inattivazione del cromosoma X è un processo biologico che consiste nella disattivazione (perdita di funzione) di uno dei due cromosomi sessuali X presenti nelle loro cellule. Tale cromosoma viene "silenziato", ovvero reso inerte dal punto di vista trascrizionale, tramite impacchettamento in un'unità densa di eterocromatina a formare una struttura inerte definita corpo di Barr; il risultato di tale processo è un'attenuata espressione, in tutte le cellule, dei geni portati dai cromosomi X, e dei fenotipi da essi manifestati. Il gene deputato a tale processo è XIST (X inactive specific transcript), che trascrive un RNA espresso solo dal cromosoma inattivato e che non codifica per alcuna proteina. Agisce sul centro di inattivazione dell'X (Xic, X inactivation center) e non è espresso nel maschio con cariotipo normale (46, XY). Ognuno dei due cromosomi X dei maschi con sindrome di Klinefelter hanno la medesima probabilità di venire attivati, ma non tutti i geni vengono silenziati: il 15% rimane in duplice copia biallelica (Aksglaede et al., 2006; Wikström et al .,2004) e si ipotizza che la iperespressione di questi geni sia responsabile del fenotipo della sindrome. In particolare il gene del recettore degli androgeni (AR), membro della super famiglia dei recettori nucleari, è regolato dai livelli di testosterone ed è oggetto di diversi studi genetici. Il gene AR è localizzato sul cromosoma X in posizione Xq11-12, codifica per un fattore di trascrizione ligando dipendente, e contiene una sequenza ripetuta polimorfica CAG nell’esone 1 codificante un tratto di poli-glutammina. L’estrema variabilità del numero delle ripetizioni determina la differente lunghezza del tratto nel dominio di trans-attivazione N-terminale (Zinn et al., 2005; Tirabassi et al., 2013; Francomano et al., 2013). Il numero di ripetizioni CAG può variare da 9 a 36 con variazioni tra le differenti etnie e gruppi razziali; infatti negli uomini caucasici sono presenti in media 21 ripetizioni, negli afro-Americani 18 e negli uomini asiatici 22 ripetizioni (Edwards et al., 1992). (Tirabassi et al., 2015). Nella donna quando il processo di inattivazione della X non avviene correttamente, può verificarsi l’inattivazione non randomica degli alleli per il recettore degli androgeni (AR) con conseguente aumento dell’attività degli androgeni e irsutismo e ovaie policistiche (Calvo et al.,2000; Vottero et al., 1999). Mutazioni del gene nell’uomo sono associate a vari disordini tra cui la sindrome dell’insensibilità completa agli androgeni (Sills et al.,2002), disturbi dei neuroni motori e cancro della prostata (MacLean et al.,1995). È stata dimostrata una relazione inversa tra il numero di ripetizioni nel tratto CAG e la trascrizione della proteina AR: sequenza più lunghe sono associate a una ridotta capacità trascrizionale con conseguente riduzione del meccanismo del feedback androgeno dipendente (Bogaert et al., 2009). Diversi possono essere i target sotto il controllo del recettore degli androgeni in uomini eugonadici: dimensione della prostata (Giovannucci et al.,1999), concentrazione dei lipidi, dell’insulina e della leptina (Zitzmann et al., 2003), funzioni endoteliali (Zitzmann et al.,2001), densità dell’osso (Zitzmann et al., 2001; Chen et al., 2003), sviluppo cognitivo (Seidman et al., 2001; Harkonen et al., 2003) e concentrazione degli spermatozoi (Von Eckardstein et al.,2001). Il rischio di insorgenza del cancro alla prostata risulta aumentato in pazienti con ripetizioni più corte (Ntais et al., 2003). Alla luce di tutto ciò scopo della mia tesi è stato quello di svolgere uno studio molecolare su pazienti affetti da Sindrome di Klinefelter, ed in particolare: 1- STUDIO 1 - identificare l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y in pazienti con Sindome di Klinefelter nella popolazione caucasica al fine di determinare se tale delezione possa aumentare il rischio di aneuploidie cromosomiche e possa avere un impatto nella gestione e nello screening genetico di questi pazienti. Al fine di valutare l’entità di tale alterazione genica nei KS abbiamo confrontato l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y in pazienti KS rispetto ai pazienti con azoospermia non ostruttiva (NOA). 2- STUDIO 2 – analizzare la lunghezza delle ripetizioni CAG e se la variazione di tale polimorfismo possa influenzare il diverso fenotipo in tale sindrome
12-dic-2018
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