Uno dei problemi legati alla crioconservazione del liquido seminale è la riduzione dei parametri vitali quali la vitalità e la motilità. La cri preservazione può inoltre indurre modificazioni della normale morfologia della componente nemaspermica. Attualmente la crioconservazione è applicabile attraverso due metodologie: congelamento lento/scongelamento rapido e vitrificazione/riscaldamento. Il primo metodo tende a prevenire la formazione di ghiaccio intracellulare tramite un lento abbassamento della temperatura: in tal modo la cristallizzazione che avviene all’esterno della cellula dovrebbe non disturbare l’ambiente intracellulare; il secondo invece mira ad evitare la formazione di ghiaccio intracellulare attraverso un istantaneo abbassamento della temperatura facendo in modo che il tempo richiesto per la transizione termica non sia tale da permettere il passaggio di stato. Per crioconservare con successo limitando il danno intracellulare si utilizzano delle sostanze dette crioprotettori, che sono però particolarmente tossici per le cellule. Una questione controversa nel campo della crioconservazione/crioprotezione dei gameti riguarda la presenza o assenza del liquido seminale durante la crioconservazione degli spermatozoi. Il potenziale protettivo del liquido seminale è stato confermato dalla presenza in esso di ioni come zinco e di antiossidanti; esso può però contenere alti livelli, potenzialmente tossici, di specie reattive dell’ossigeno. Lo scopo di questa tesi è stato quello di testare gli effetti di un medium di coltura artificiale simile nella composizione al liquido seminale ma privo degli effetti collaterali negativi e valutare il suo effetto sugli spermatozoi umani andando ad analizzare una serie di parametri prima e dopo la vitrificazione. In particolare mediante analisi microscopica sono stati valutati motilità, vitalità, morfologia e ultrastruttura. Sono stati selezionati 30 campioni di liquido seminale e ogni campione è stato sottoposto a swim-up e successivamente trattato in modo da ottenere 5 gruppi di spermatozoi a fresco e vitrificati in diversi media: HTF a fresco (Human Tubal Fluid), ASF a fresco (Artificial Seminal Fluid), Vit HTF (vitrification in Human Tubal Fluid), Vit SF (vitrification in Seminal Fluid), Vit ASF (vitrification in Artifical Seminal Fluid). Dopo vitrificazione e scongelamento tutti i campioni sono stati sottoposti ad analisi seminale mediante l’utilizzo della Microscopia Ottica, e successivamente sono stati trattati per l’analisi ultrastrutturale mediante l’uso della Microscopia Elettronica a Trasmissione. Nei gruppi a fresco HTF e ASF, tutti i parametri nemaspermici sono risultati simili e paragonabili. Invece, come era prevedibile, i parametri relativi alla morfologia normale, motilità e vitalità sono apparsi significativamente ridotte nei gruppi vitrificati rispetto a quelli a fresco (p<0.001). Andando a paragonare i parametri in condizioni di vitrificazione diverse invece, la motilità progressiva, la vitalità e la normale morfologia sono significativamente più alte in Vit ASF rispetto a Vit HTF, mentre tutti i parametri risultano in generale migliori in Vit ASF rispetto a Vit SF ma solo la vitalità sembra differire in maniera significativa. I tassi di recupero di vitalità e della normale morfologia erano significativamente maggiori nel gruppo Vit ASF rispetto a Vit SF e Vit HTF (p<0.05). I tassi di recupero della motilità progressiva e della normale morfologia erano significativamente maggiori nel gruppo Vit ASF rispetto a Vit HTF (p=0.03). Analizzando le immagini scattate al microscopio elettronico a trasmissione degli spermatozoi a fresco e vitrificati, i campioni a fresco hanno mostrato membrana plasmatica intatta e normali acrosomi. Nonostante si sia notata una migliore preservazione nel gruppo Vit ASF sono stati osservati diversi tipi di danno in tutti i gruppi vitrificati, nei quali l’acrosoma è risultata la parte anatomica più sensibile al crio-danno. La membrana plasmatica ha mostrato molti difetti dopo lo scongelamento come rigonfiamento, rotture, raggrinzimenti. Nei nuclei dei vitrificati è stata osservata una minore elettrodensità rispetto ai controlli a fresco e sono state osservate inclusioni granulari, voluminosi vacuoli apparentemente vuoti e non delimitati da membrana posizionati solitamente al centro del nucleo. I mitocondri sono apparsi tondi con creste poco definite e visibili. In conclusione abbiamo potuto dimostrare che il liquido seminale (SF) può fungere da crioprotettore in soggetti normospermici. Abbiamo dimostrato inoltre che l’ASF può effettivamente meglio preservare tutti i parametri nemaspermici degli spermatozoi in confronto al SF, ma soprattutto in confronto al HTF, incrementato con albumina sierica e saccarosio.

Valutazione dei parametri nemaspermici di spermatozoi umani vitrificati mediante liquido seminale artificiale, in assenza di crioprotettore / Miglietta, Selenia. - (2018 Feb 17).

Valutazione dei parametri nemaspermici di spermatozoi umani vitrificati mediante liquido seminale artificiale, in assenza di crioprotettore

MIGLIETTA, SELENIA
17/02/2018

Abstract

Uno dei problemi legati alla crioconservazione del liquido seminale è la riduzione dei parametri vitali quali la vitalità e la motilità. La cri preservazione può inoltre indurre modificazioni della normale morfologia della componente nemaspermica. Attualmente la crioconservazione è applicabile attraverso due metodologie: congelamento lento/scongelamento rapido e vitrificazione/riscaldamento. Il primo metodo tende a prevenire la formazione di ghiaccio intracellulare tramite un lento abbassamento della temperatura: in tal modo la cristallizzazione che avviene all’esterno della cellula dovrebbe non disturbare l’ambiente intracellulare; il secondo invece mira ad evitare la formazione di ghiaccio intracellulare attraverso un istantaneo abbassamento della temperatura facendo in modo che il tempo richiesto per la transizione termica non sia tale da permettere il passaggio di stato. Per crioconservare con successo limitando il danno intracellulare si utilizzano delle sostanze dette crioprotettori, che sono però particolarmente tossici per le cellule. Una questione controversa nel campo della crioconservazione/crioprotezione dei gameti riguarda la presenza o assenza del liquido seminale durante la crioconservazione degli spermatozoi. Il potenziale protettivo del liquido seminale è stato confermato dalla presenza in esso di ioni come zinco e di antiossidanti; esso può però contenere alti livelli, potenzialmente tossici, di specie reattive dell’ossigeno. Lo scopo di questa tesi è stato quello di testare gli effetti di un medium di coltura artificiale simile nella composizione al liquido seminale ma privo degli effetti collaterali negativi e valutare il suo effetto sugli spermatozoi umani andando ad analizzare una serie di parametri prima e dopo la vitrificazione. In particolare mediante analisi microscopica sono stati valutati motilità, vitalità, morfologia e ultrastruttura. Sono stati selezionati 30 campioni di liquido seminale e ogni campione è stato sottoposto a swim-up e successivamente trattato in modo da ottenere 5 gruppi di spermatozoi a fresco e vitrificati in diversi media: HTF a fresco (Human Tubal Fluid), ASF a fresco (Artificial Seminal Fluid), Vit HTF (vitrification in Human Tubal Fluid), Vit SF (vitrification in Seminal Fluid), Vit ASF (vitrification in Artifical Seminal Fluid). Dopo vitrificazione e scongelamento tutti i campioni sono stati sottoposti ad analisi seminale mediante l’utilizzo della Microscopia Ottica, e successivamente sono stati trattati per l’analisi ultrastrutturale mediante l’uso della Microscopia Elettronica a Trasmissione. Nei gruppi a fresco HTF e ASF, tutti i parametri nemaspermici sono risultati simili e paragonabili. Invece, come era prevedibile, i parametri relativi alla morfologia normale, motilità e vitalità sono apparsi significativamente ridotte nei gruppi vitrificati rispetto a quelli a fresco (p<0.001). Andando a paragonare i parametri in condizioni di vitrificazione diverse invece, la motilità progressiva, la vitalità e la normale morfologia sono significativamente più alte in Vit ASF rispetto a Vit HTF, mentre tutti i parametri risultano in generale migliori in Vit ASF rispetto a Vit SF ma solo la vitalità sembra differire in maniera significativa. I tassi di recupero di vitalità e della normale morfologia erano significativamente maggiori nel gruppo Vit ASF rispetto a Vit SF e Vit HTF (p<0.05). I tassi di recupero della motilità progressiva e della normale morfologia erano significativamente maggiori nel gruppo Vit ASF rispetto a Vit HTF (p=0.03). Analizzando le immagini scattate al microscopio elettronico a trasmissione degli spermatozoi a fresco e vitrificati, i campioni a fresco hanno mostrato membrana plasmatica intatta e normali acrosomi. Nonostante si sia notata una migliore preservazione nel gruppo Vit ASF sono stati osservati diversi tipi di danno in tutti i gruppi vitrificati, nei quali l’acrosoma è risultata la parte anatomica più sensibile al crio-danno. La membrana plasmatica ha mostrato molti difetti dopo lo scongelamento come rigonfiamento, rotture, raggrinzimenti. Nei nuclei dei vitrificati è stata osservata una minore elettrodensità rispetto ai controlli a fresco e sono state osservate inclusioni granulari, voluminosi vacuoli apparentemente vuoti e non delimitati da membrana posizionati solitamente al centro del nucleo. I mitocondri sono apparsi tondi con creste poco definite e visibili. In conclusione abbiamo potuto dimostrare che il liquido seminale (SF) può fungere da crioprotettore in soggetti normospermici. Abbiamo dimostrato inoltre che l’ASF può effettivamente meglio preservare tutti i parametri nemaspermici degli spermatozoi in confronto al SF, ma soprattutto in confronto al HTF, incrementato con albumina sierica e saccarosio.
17-feb-2018
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