Profilo delle cellule tumorali staminali di colangiocarcinoma in situ, in vitro ed in circolo: correlati clinico-patologici e prognostici

OBIETTIVI PROGETTO 1. Valutare se la presenza di CTC, valutate con metodica Cell Search TM System (EpCAM+, CK8+/18+, DAPI+ e CD45-) e Screen Cell System (EpCAM, LGR5, CD90, CD13, CD133), nel sangue periferico di pazienti affetti da colangiocarcinoma, abbia un valore prognostico e se possa correlare con la risposta al trattamento terapeutico di prima linea. I parametri valutati sono stati il Response Rate (RR), PFS ed OS. 2. Valutare l’espressione di DCLK1 in sottopopolazioni di CCA-CSC selezionate per EpCAM, LGR5, CD90, CD13, CD133 nei due istotipi (mucinoso e misto) e gli effetti dell’inibizione di DCLK1 su vitalità e proliferazione delle cellule di CCA; PAZIENTI E METODI: Abbiamo valutato in maniera retrospettiva e prospettica pazienti affetti da CCA sottoposti a resezione chirurgica radicale o a biopsia: cinquanta (n= 50) pazienti totali, di cui 23 valutabili retrospettivamente per analisi su tessuto istologico correlabili con dati clinici; 20 pazienti in modalità prospettica con ricerca ed analisi delle cellule tumorali circolanti (CTC) e sei pazienti per la caratterizzazione molecolare di CSC in vitro. Per la valutazione delle CTC mediante CellSearch (EpCAM+, CK8+/18+, DAPI+ e CD45-) e ScreenCell (EpCAM, LGR5, CD90, CD13, CD133) i pazienti sono stati sottoposti a prelievi di siero ematico al momento della diagnosi e prima di ogni ciclo di chemioterapia e con stessa tempistica a TC Total Body. Infine, il tessuto di CCA umano, ottenuto da 6 pazienti con CCA sottoposti a resezione chirurgica, è stato digerito enzimaticamente, immunosoldato per specifici marcatori CSC (LGR5, CD133, EpCAM, CD90, CD13) e preparato in colture cellulari primarie. L'espressione di DCLK1 in colture cellulari primarie di iCCA ed eCCA è stata analizzata mediante RT-qPCR, Western Blot (WB), immunofluorescenza (IF) ed ELISA. Inoltre abbiamo valutato, mediante MTS Assay e il tempo di raddoppiamento della popolazione cellulare (PDT), l'effetto di un inibitore selettivo di DCLK1, LRRK2-IN-1, sulla proliferazione cellulare e l'apoptosi è stata valutata da Annessin-V-FITC / Propidio Ioduro; la capacità di formazione di colonie è stata valutata da saggio clonogenico. L'inibitore DCLK1, LRRK2-IN-1 (5μM), è stato aggiunto per 3 giorni nelle colture cellulari CCA. CARATERIZZAIONE DEI PAZIENTI Classificazione istologica sec. Komuta et al1-5 (collaborazione con il gruppo del Prof. Gaudio). 14 casi di IH-CCA, 50% mucinosi e 50% misti; 9 casi di p-CCA (mucinosi). Descrizione caratteristiche pazienti e tumore: - iCCA: 64.3% femmine vs 35.7% maschi; perilare pCCA: 66.7% maschi vs 32.3% femmine. Range età: 25-77 anni; età mediana di 61 aa iCCA vs 67 aa pCCA); BMI medio di 27.3 (BMI Range: 19 - 42); 23 pazienti con PS 0 sec. ECOG. - dati bio-umorali, CA 19.9 medio, iCCA = 55.8 U/ml vs pCCA = 67.3 U/ml; - 23 pazienti affetti da CCA, di cui 14 iCCA e 9 pCCA; Grading secondo AJCC13, G1-2 = 56.5% vs G3-4 = 39.1%; iCCA: G1-2 = 50% vs G3-4= 50%; pCCA: G1-2 = 66.7% vs G3-4 = 33.3%. - 14 pazienti valutabili per stadiazione clinica e patologica (TNM)10-13; pazienti arruolati 43.5% stadio I-II vs 56.5% stadio III-IV; iCCA: 26% stadio I-II vs 17.4% stadio III-IV; R state, prevalenza R0 nei pazienti iCCA (28.6% vs 22.2%); Per la ricerca di CTC, da gennaio del 2015 a luglio del 2017 sono stati sottoposti a prelievo di sangue intero, 20 pazienti con diagnosi di Colangiocarcinoma in fase avanzata, prima di iniziare una linea di terapia. Dieci pazienti, ritenuti eleggibili per il nostro studio in quanto valutabili per RR e PFS, sono stati analizzati mediante CelleSearch di Veridex; altri 5 pazienti eleggibili per lo studio, sono stati esaminati mediante ScreenCell. Due pazienti sono stati esclusi dall'analisi in quanto hanno ritirato il consenso prima dell'esecuzione della prima TC di rivalutazione; in due casi i pazienti sono stati esclusi perché avevano un prelievo basale di CTC non diagnostico ed infine un paziente è stato escluso in quanto ha cambiato centro e non è stato possibile ricostruire la sua storia. I pazienti arruolati comprendono 5 uomini e 10 donne. L’età mediana dei pazienti arruolati era di 64 anni (range: 38 - 80 anni, media: 62.7 anni), il loro ECOG PS era pari a 0 o 1 rispettivamente nel 73.3% dei casi (11 pazienti) e nel 26.7% dei casi (4 pazienti). Il sito più comune di metastatizzazione è risultato essere il fegato con un totale di 12 pazienti (80%), seguito dal polmone con 3 pazienti (20%) e dal peritoneo con 3 pazienti (20%). I tumori erano caratterizzati nel seguente modo: 11 (73%) iCCA, 4 (27%) pCCA, 0 (0%) dCCA. Sette pazienti erano stati sottoposti a chemioterapia adiuvante (47%%). L’intervento chirurgico di asportazione del tumore primitivo è stato eseguito in 6 pazienti (40%). Nei restanti casi la diagnosi è stata posta tramite agobiopsia su metastasi. Tutti i pazienti sono stati stadiati prima del dosaggio delle CTC e prima dell’inizio della terapia con TC-Total Body. RISULTATI: Per la valutazione retrospettiva della correlazione tra caratterizzazione istologica e outcome prognostico, solamente i pazienti affetti da iCCA sono stati valutabili per DFS e OS: DFS mediana = 11 mesi (range 4-26 mesi); OS mediana = 22.5 mesi (range 10-36 mesi); iCCA mucinosi vs iCCA misti: DFS mediana 12 mesi (range 4-26 mesi) vs 10 mesi (range 4-13 mesi); OS mediana 24 mesi (21-29 mesi) vs 12 mesi (10-36 mesi). I risultati hanno dimostrato nessuna differenza statisticamente significativa in DFS ed OS, sebbene vi sia un lieve trend di un miglior outcome per la tipologia CCA-Mucinosi. 1) Ricerca di CTC utilizzando la tecnica CellSearch (CD45-, EpCAM+ e citocheratine 8, 18+ e/o 19+); sono stati arruolati 10 pazienti (CCA1-10) affetti da CCA (IH) di cui 3 in stadio II e 7 in stadio IV al momento della diagnosi, candidati ad un trattamento chemioterapico di prima linea e rivalutati con CTC e TC Total Body ogni tre cicli di terapia con i seguenti risultati ad follow up mediano di 16 mesi (Range: 3 – 18 mesi): • un paziente donna (CCA-1), stadio III non operabile alla diagnosi, positiva per 6 CTC al T0 e assenza di CTC al T1 in corrispondenza di stabilità di malattia alla TC Total Body; mentre al T2, ha presentato 4 CTC e progressione radiologica di malattia; paziente deceduto dopo 9 mesi dall’inizio della chemioterapia. • una paziente donna (CCA-2), stadio III non operabile alla diagnosi, con assenza di CTC al T0, ma deceduta per progressione di malattia prima di essere rivalutata radiologicamente e con CTC; paziente deceduto dopo 3 mesi dall’inizio della chemioterapia. • un paziente uomo (CCA-3), stadio IV, positivo per 1 CTC al T0, 2 CTC al T1 con risposta parziale di malattia alla TC Total Body; 4 CTC al T2 con evidenza di stabilità radiologica di malattia; e 0 CTC al T3 con progressione di malattia alla TC; paziente deceduto dopo 12 mesi dall’inizio della chemioterapia. • un paziente donna (CCA-4), stadio III non operabile alla diagnosi, positiva per 1 CTC al T0, nessuna CTC al T1 con risposta parziale di malattia radiologica; 1 CTC al T2 con stabilità di malattia alla TC Total body; 3 CTC al T3 con progressione radiologica di malattia; paziente deceduto dopo 15 mesi dall’inizio della chemioterapia. • un paziente donna (CCA-5), stadio IV, 0 CTC al T0, 1 CTC al T1 con risposta parziale di malattia alla TC TB; 2 CTC al T2 con stabilità di malattia; 2 CTC al T3 con stabilità di malattia; 2 CTC al T4 con stabilità di malattia; 5 CTC al T5 con progressione radiologica di malattia; paziente deceduto dopo 18 mesi dall’inizio della chemioterapia. • un paziente uomo (CCA-6), stadio IV, 0 CTC al T0, T1, T2, T3 E T4; paziente deceduto per progressione di malattia poco prima della rivalutazione al T5; paziente deceduto dopo 15 mesi dall’inizio della chemioterapia. • un paziente uomo (CCA-7), stadio IV, 3 CTC al T0, 1 CTC al T1 con risposta parziale di malattia alla TC Total Body; 1 CTC al T2 con stabilità radiologica di malattia; 0 CTC al T3 con stabilità di malattia alla TC Total Body; 0 CTC al T4 con progressione radiologica di malattia; paziente deceduto dopo 15 mesi dall’inizio della chemioterapia. • un paziente donna (CCA-8), stadio IV, 3 CTC al T0, 4 CTC al T1 con progressione di malattia alla TC TB; paziente deceduto dopo 6 mesi dall’inizio della chemioterapia. • un paziente uomo (CCA9), stadio IV, con 1 CTC al T0, 2 CTC al T1 con stabilità di malattia alla TC TB; e 0 CTC al T2 con progressione radiologica di malattia seguita da decesso della paziente prima della successiva rivalutazione; paziente deceduto dopo 9 mesi dall’inizio della chemioterapia. • un paziente donna (CCA10), stadio IV, 1 CTC al T0; 1 CTC al T1 con stabilità di malattia, 2 CTC al T2 con progressione radiologica di malattia; paziente deceduto dopo 9 mesi dall’inizio della chemioterapia. Dunque, nel 50% dei pazienti, ad un aumento numerico di CTC in corso di chemioterapia di prima linea si è avuto una progressione radiologica di malattia; e sempre nel 50% dei pazienti, l’assenza o l’azzeramento del numero di CTC si è verificato in corrispondenza del decesso del paziente. - Ricerca di CTC utilizzando la tecnica ScreenCell: EpCAM, LGR5, CD90, CD13, CD133. Sono stati arruolati 5 pazienti (CCA11-15), di cui 3 allo stadio III (non operabili) e 2 allo stadio IV. Ad un follow up mediano di 9 mesi: i 5 pazienti arruolati non sono mai risultati positivi per CTC in nessuno dei prelievi effettuati. 2) Le analisi RT-qPCR e WB hanno dimostrato una maggiore espressione di DCLK1 nelle cellule di mucin-eCCA LGR5+ e in cellule CD133+ miste-iCCA rispetto a cellule non differenziate (p <0,01). Negli esperimenti con IF, DCLK1 ha mostrato una localizzazione citoplasmatica simile nelle cellule CCA LGR5+, CD133+. È interessante notare che il DCLK1 è stato rilevato dall'ELISA nei campioni di siero umano di pazienti affetti da CCA, ma era quasi irrilevabile nei controlli sani. LRRK2-IN-1 ha marcatamente ridotto la proliferazione cellulare, ha aumentato la PDT e l’apoptosi indotta, e diminuito la capacità di formazione di colonie e le dimensione delle colonie sia in iCCA che in eCCA rispetto alle cellule di controllo non trattate (p <0,01). Le analisi delle curve dose-risposta mediante saggio MTS hanno dimostrato che l'effetto antiproliferativo di LRRK2-IN-1 è dose-dipendente (2,5μM-20μM) con un IC50 di 9,61 μM in mucina-eCCA, 14,72 μM in iCCA misto, 4,51 μM in mucin-LGR5+ e 9.61μM in cellule CD133+ miste. CORRELAZIONI PROGNOSTICHE - CellSearch: la OS mediana di tutti i 10 pazienti, indipendentemente dal valore riscontrato nella ricerca delle CTC, è stata di 10.5 mesi (range: 3 – 18 mesi); la OS media è stata di 11.1 mesi (range: 3 – 18 mesi). Confrontando infine tutti e 5 i sottogruppi (pazienti con CTC pari a zero, pazienti con CTC ≥1, pazienti con CTC < 3, CTC ≥ 3 e 1 < CTC ≤ 3) i valori di PFS media sono risultati essere rispettivamente: 8 mesi, 7.3 mesi, 7.7 mesi, 8 mesi e 7.5 mesi; i valori di PFS mediana sono risultati essere rispettivamente: 9 mesi, 6 mesi, 6 mesi, 6 mesi e 7.5 mesi; i valori di OS media sono risultati essere rispettivamente: 12 mesi, 11.3 mesi, 11.6 mesi, 10 mesi e 10.5 mesi; i valori di OS mediana sono risultati essere rispettivamente: 15 mesi, 10.5 mesi, 12 mesi, 9 mesi e 10.5 mesi; mentre i valori del RR sono risultati essere rispettivamente: 33%, 28.6%, 28.6%, 33% e 0%. CONCLUSIONI Per quanto riguarda lo studio con CellSearch di Veridex, possiamo dire che il cut-off CTC ≥ 1 vs CTC = 0 potrebbe avere una sua utilità come fattore prognostico negativo. Infatti individua un gruppo di pazienti a prognosi infausta, sia in termini di trend di PFS media e mediana (7.3 e 6 mesi vs. 8 e 9 mesi), che di OS media e mediana (11.3 e 10.5 mesi vs. 12 e 15 mesi), che di RR (28.6% vs. 33%). La ridotta numerosità campionaria potrebbe giustificare il non raggiungimento di un p value significativo. Comunque il cut-off CTC ≥ 1 si è rivelato egualmente efficace rispetto a CTC ≥ 3 sia in termini di PFS media e mediana (7.3 e 6 mesi per i pazienti con CTC ≥ 1 vs 8 e 6 mesi per i pazienti con CTC ≥ 3), che di OS media e mediana (11.3 e 10.5 mesi per i pazienti con CTC ≥ 1 vs 10 e 9 mesi per i pazienti con CTC ≥ 3), che per quel che riguarda il RR (28.6% per i pz con CTC ≥ 1 vs 3% per i pz con CTC ≥ 3). Per ciò che riguarda lo studio di DCLK1, specifiche sottopopolazioni di CSC di ICCA misto (CD133+) e mucin-eCCA (LGR5+) sono state caratterizzate dall'espressione di DCLK1. DCLK1 potrebbe rappresentare un biomarcatore sierico per il CCA. L'inibizione di DCLK1 esercita effetti anti-neoplastici nelle colture cellulari primarie di CCA. L’utilizzo dello ScreenCell, almeno per quanto riguarda pazienti affetti da CCA, a nostro parere richiederebbe una modifica della tecnica che preveda una preselezione cellulare mediante CellSearch con l’utilizzo di tutti e 4 i canali del Veridex inserendo le CK 7,8,18,19 e DCLK-1.