Spettroscopia NMR multinucleare e analisi metabolomica applicata alla caratterizzazione del fenotipo metabolico di sistemi complessi

La metabolomica, negli ultimi anni, è diventata un approccio versatile, largamente impiegato nell’industria e nella ricerca nel campo delle scienze mediche, biologiche, ambientali e alimentari [1,2,3]. In ambito microbiologico la metabolomica viene spesso utilizzata per la caratterizzazione del fenotipo di microrganismi, volta all’ottimizzazione della produzione biotecnologia di sostanze come vitamine, enzimi e antibiotici. In seguito all’avvento della tecnologia del DNA ricombinante è stata applicata nell’ingegneria metabolica per la produzione di metaboliti primari e secondari [4]. Nel presente lavoro e’ stata applicata la metabolomica, basata su spettroscopia di risonanza magnetica multinucleare ad alta risoluzione e modelli di analisi multivariata, per caratterizzare le variazioni del fenotipo metabolico di un sistema complesso dipendente da una mutazione genica e per valutare il suo adattamento in funzione di variazioni ambientali. Lo studio è stato condotto su un sistema biologico costituito da cellule eucariote di lieviti kluyveromyces lactis, wild type e geneticamente modificate, fornite dai laboratori del Dipartimento di Biologia e Biotecnologie. La strategia di metabolic profiling adottata risponde alla necessità di una metodologia che possa caratterizzare organismi complessi descrivendone il fenotipo metabolico in diverse condizioni e consiste nell’identificazione e quantificazione dei metaboliti coinvolti nei flussi attraverso e tra le varie vie metaboliche per la produzione di energia e di materia [5]. Le variazioni nel metaboloma sono state valutate tramite spettroscopia NMR multinucleare, mappe di correlazione e analisi multivariata dei dati. L’analisi NMR ha il vantaggio di non richiedere una preparazione dei campioni particolarmente impegnativa; si è quindi eseguita una estrazione tramite il metodo Bligh and Dyer [6] modificato dal nostro laboratorio [7] ottenendo degli estratti idro-alcolici ed organici, sui quali sono stati effettuati spettri monodimensionali di 1H e spettri bidimensionali (omonucleari TOCSY ed eteronucleari HSQC e HMBC). Si è rivolta particolare attenzione agli aspetti metodologici ottimizzando, per ogni esperimento, la risoluzione e la sensibilità al fine di assicurare la riproducibilità richiesta da un approccio di tipo metabolomico. L’analisi metabolomica ha consentito, quindi, la valutazione delle variazioni nell’intero metaboloma, dipendenti da una singola mutazione genica. I risultati hanno portato alla costruzione di un modello di rete metabolica per il ceppo wild type e per il rispettivo mutante. [1] Powers R, Magnetic Resonance in Chemistry 2009, 47, S2-S11. [2] Sobolev AP, Brosio E, Gianferri R, Segre AL, Magn. Reson. Chem. 2005, 43, 625–638. [3] Mannina L, Cristinzio M, Sobolev AP, Ragni P, Segre AL, J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 7988–7996. [4] Mashego MR, Rumbold K, De Mey M, Vandamme E, Soetaert W, Heijnen JJ, Biotechnol. Lett. 2007, 29, 1-16. [5] Miccheli A, Tomassini A, Puccetti C, Valerio M, Peluso G, Tuccillo F, Calvani M, Manetti C, Conti F, Biochimie 2006, 88, 437-448. [6] Bligh EG, Dyer WJ, Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37, 911-917. [7] Miccheli A, Aureli T, Delfini M, Di Cocco ME, Viola P, Gobetto R, Conti F, Cell. Mol. Biol. 1998, 34, 591–603.