La recente scoperta di nuovi virus appartenenti alla famiglia dei Coronaviridae (hCoV-229E, hCoV-OC43, hCoV-SARS, hCoV-NL63 ed hCoV-HKU1) e le nuove emergenze epidemiche legate all'influenza aviaria, hanno portato la comunità scientifica e l'opinione pubblica, a riflettere sull'attuale pericolo costituito dalle infezioni da virus respiratori. Già a metà anni '60, in seguito a studi effettuati su volontari, comprendenti una serie di indagini sieroepidemiologiche, furono identificati i primi due coronavirus umani che chiamati hCoV-229E e hCoV-OC43 Da questi studi, i ricercatori appresero che l'infezione con 229E e OC43 provocava un comune raffreddore e da allora in poi i coronavirus umani, furono considerati come agenti patogeni respiratori relativamente innocui Nel 2004 due gruppi di ricercatori olandesi (Fouchier e.;van der Hoek ) e un gruppo dall'USA (Esper) nel, 2005 descrivono nuovi hCoV, chiamati NL63 e New Haven.Questo virus è correlato con hCoV-229E, è descritto come un agente virale associato ad infezioni del tratto respiratorio in bambini ospedalizzati. Inoltre, un altro hCoV (siglato HKU1), correlato con hCoVOC43, è stato isolato in due pazienti di Hong-Kong con polmonite (Woo et al., 2005, Sloots et al., 2006; Vabret et al.,2006) Questi nuovi virus possono essere aggiunti ai precedentemente studiati , OC43 and 229E..Ancora poco conosciuta la patogenesi delle malattie causate dai Coronavirus (hCoV); si sa che possiedono uno specifico tropismo per l'apparato respiratorio, in particolare per l'epitelio ciliato della trachea, mucosa nasale e alveoli polmonari ed inoltre per l'apparato gastroenterico a livello degli enterociti. Le infezioni da HKU1 e NL63 generalmente non danno quadri clinici gravi; ma quanto sopra esposto ci ha suggerito che l'NL63 e l'HKU1, come anche il 229E e l'OC43, sono virus del comune raffreddore ) che possono poi causare sintomi clinici più gravi in persone immunocompromesse Ci sembra quindi interessante studiare una campionatura di pazienti Italiani ricoverati presso il Policlinico Umberto I di Roma, tutti immunocompromessi., provenienti da diversi reparti in particolare pazienti sottoposti a trapianto d'organo, e soggetti con malattie ematologiche fascia di età varibile Per il nostro progetto gli antigeni dei coronavirus sono stati prodotti attraverso la formazione di un complesso tra il Glutadione -Stranferrasi(GST) e le proteine di fusione espresse su cellule di insetti infettate da baculovirus ricombinanti.Il lisato delle cellule infette può essere utilizzato direttamente nelle piastre ELISA ricoperte con glutatione-caseina, le quali hanno un'alta affinità per il complesso GST- proteine di fusione. Questo tipo di metodica per la produzione degli antigeni, è relativamente facile ed è molto importante per il nostro progetto perché il numero dei coronavirus umani conosciuti è in espansione e le molte proteine virali ( nucleocapside, proteine di membrana e le spicole proteiche dell'envelope) sono i bersagli potenziali della risposta anticorpale.Preparazione antigeni virali Clonaggio ed espressione degli antigeni dei coronavirus Le sequenze nucleotidiche che codificano la produzione delle proteine del nucleocapside dei Coronavirus umani OC43, NL63, 229E,HKU1, sono state sintetizzate e successivamente clonate in un vettore transfer pAB-GST BACULOVIRUS modificato.Il plasmide, è stato ricombinato con ProEasy linearized baculovirus DNA ( ABVector) all'interno di cellule di insetto SF9, come da protocollo.Le proteine del nucleocapside dei coronavirus sono stati fatti esprimere in cellule di insetto Trichoplusia ni ( High Five),come proteine di fusione glutadione -S-transferasi (GST).Per confermare l'espressione delle proteine di fusione, il lisato delle cellule di insetto è stato analizzato tramite metodi standard di immuno blotting ( Sambrook and Russel, 2001). Successivamente, sono stati utilizzati anticorpi anti-GST coniugati a una perossidasi, per verificare la presenza degli antigeni a dimostranza della loro corretta adesione alla fase solida dell'ELISA. Preparazione degli antigeni virali per l'ELISA Per la produzione degli antigeni, le cellule High Five sono state infettate con un baculovirus ricombinante e fatte crescere in piastre per colture cellulari, utilizzando come terreno di coltura l'Ex-Cell 400. Dopo 72 ore di incubazione a 27°C, le cellule vengono staccate dalle piastre e risospese in PBS contenente EDTA , NP-40 ed un cocktail di inibitori di proteasi. Dopo una incubazione di 30' in ghiaccio, la sospensione cellulare viene sonicata per 2 volte in ghiaccio per 60''. Il lisato viene quindi centrifugato a 10000 giri per 15'; il sovranatante viene quindi raccolto e stoccato a -80°CGSTfusion protein ELISA Gli anticorpi verso le proteine del nucleocapside dei coronavirus vengono misurati con la tecnica ELISA, che utilizza come metodo di cattura il glutadione-S-tranferasi (GST) con alcune modificazioni ( Sehr et al, 2001). Il fondo dei 96 pozzetti di piastre PolySorb è stato sensibilizzato overnight a 4°C con glutadione-caseina in tampone carbonato a pH 9,6 e bloccato per 1 ora a 37°C con caseina e alcool polivinilico in PBS ( tampone- caseina PVA).Le piastre bloccate vengono incubate, quindi, per 1 ora a temperatura ambiente con le cellule di insetto lisate contenenti le proteine di fusione GST diluite con tampone-caseina PVA. La diluizione ottimale di ogni lisato viene eseguita con una serie di diluizioni seriali, prima di iniziare il test ELISA, utilizzando anticorpi verso la sequenza carbossiterminale del peptide antigenico del poliomavirus bovino (BPV), come anticorpo primario. Viene, quindi, controllato che i pozzetti siano coperti solo con il lisato di cellule di insetto che esprimono le proteine GST.Prima di aggiungere i sieri in esame e proseguire con la metodica, le piastre devono essere lavate 4 volte con PBS contenente Tween 20 per mezzo di un washer per piastre automatico.I sieri in esame, diluiti 1:100 con tampone-caseina, si mettono ad incubare per 1 ora a37°C.Il legame antigene-anticorpo è evidenziato per mezzo di una perossidasi coniugata ad anticorpi di capra, diretti contro le Immunoglobuline umane IgG e cateneGamma specifiche e diluiti 1:4000 in tampone-caseina PVA contenente polivinilpirrolidone e Tween 20. Dopo 30 minuti a 37°C, lo sviluppo del colore è dovuto all'aggiunta di una soluzione di perossido di idrogeno. La reazione viene bloccata dopo 20 minuti, con l'aggiunta di dodecil solfato , dopodiché viene misurata l'assorbanza a 405nm.L'assorbanza nei pozzetti contenenti solo GST è sottratta dall'assorbanza rilevata nei pozzetti dove sono presenti le proteine del nucleocapside legate al GST dei coronavirus, indicando, così,una reattività antigenica specifica.Dall'analisi dei risultati vorremmo valutare la diffusione di questi nuovi coronavirus in una popolazione di pazienti italiani immunocompromessiimmunocompromessi , se possibile valutare una corrispondenza con il quadro clinico e confrontare i risultati con la nostra precedente esperienza su pazienti pediatrici.
PRESENZA DI NUOVI CORONAVIRUS: NL63 E HKU1 IN PAZIENTI IMMUNOCOMPROMESSI / Rivanera, Daniela; Lozzi, M. A. FREDA A.; Suatoni, G; Nardis, C.. - (2009).
PRESENZA DI NUOVI CORONAVIRUS: NL63 E HKU1 IN PAZIENTI IMMUNOCOMPROMESSI
RIVANERA, Daniela;
2009
Abstract
La recente scoperta di nuovi virus appartenenti alla famiglia dei Coronaviridae (hCoV-229E, hCoV-OC43, hCoV-SARS, hCoV-NL63 ed hCoV-HKU1) e le nuove emergenze epidemiche legate all'influenza aviaria, hanno portato la comunità scientifica e l'opinione pubblica, a riflettere sull'attuale pericolo costituito dalle infezioni da virus respiratori. Già a metà anni '60, in seguito a studi effettuati su volontari, comprendenti una serie di indagini sieroepidemiologiche, furono identificati i primi due coronavirus umani che chiamati hCoV-229E e hCoV-OC43 Da questi studi, i ricercatori appresero che l'infezione con 229E e OC43 provocava un comune raffreddore e da allora in poi i coronavirus umani, furono considerati come agenti patogeni respiratori relativamente innocui Nel 2004 due gruppi di ricercatori olandesi (Fouchier e.;van der Hoek ) e un gruppo dall'USA (Esper) nel, 2005 descrivono nuovi hCoV, chiamati NL63 e New Haven.Questo virus è correlato con hCoV-229E, è descritto come un agente virale associato ad infezioni del tratto respiratorio in bambini ospedalizzati. Inoltre, un altro hCoV (siglato HKU1), correlato con hCoVOC43, è stato isolato in due pazienti di Hong-Kong con polmonite (Woo et al., 2005, Sloots et al., 2006; Vabret et al.,2006) Questi nuovi virus possono essere aggiunti ai precedentemente studiati , OC43 and 229E..Ancora poco conosciuta la patogenesi delle malattie causate dai Coronavirus (hCoV); si sa che possiedono uno specifico tropismo per l'apparato respiratorio, in particolare per l'epitelio ciliato della trachea, mucosa nasale e alveoli polmonari ed inoltre per l'apparato gastroenterico a livello degli enterociti. Le infezioni da HKU1 e NL63 generalmente non danno quadri clinici gravi; ma quanto sopra esposto ci ha suggerito che l'NL63 e l'HKU1, come anche il 229E e l'OC43, sono virus del comune raffreddore ) che possono poi causare sintomi clinici più gravi in persone immunocompromesse Ci sembra quindi interessante studiare una campionatura di pazienti Italiani ricoverati presso il Policlinico Umberto I di Roma, tutti immunocompromessi., provenienti da diversi reparti in particolare pazienti sottoposti a trapianto d'organo, e soggetti con malattie ematologiche fascia di età varibile Per il nostro progetto gli antigeni dei coronavirus sono stati prodotti attraverso la formazione di un complesso tra il Glutadione -Stranferrasi(GST) e le proteine di fusione espresse su cellule di insetti infettate da baculovirus ricombinanti.Il lisato delle cellule infette può essere utilizzato direttamente nelle piastre ELISA ricoperte con glutatione-caseina, le quali hanno un'alta affinità per il complesso GST- proteine di fusione. Questo tipo di metodica per la produzione degli antigeni, è relativamente facile ed è molto importante per il nostro progetto perché il numero dei coronavirus umani conosciuti è in espansione e le molte proteine virali ( nucleocapside, proteine di membrana e le spicole proteiche dell'envelope) sono i bersagli potenziali della risposta anticorpale.Preparazione antigeni virali Clonaggio ed espressione degli antigeni dei coronavirus Le sequenze nucleotidiche che codificano la produzione delle proteine del nucleocapside dei Coronavirus umani OC43, NL63, 229E,HKU1, sono state sintetizzate e successivamente clonate in un vettore transfer pAB-GST BACULOVIRUS modificato.Il plasmide, è stato ricombinato con ProEasy linearized baculovirus DNA ( ABVector) all'interno di cellule di insetto SF9, come da protocollo.Le proteine del nucleocapside dei coronavirus sono stati fatti esprimere in cellule di insetto Trichoplusia ni ( High Five),come proteine di fusione glutadione -S-transferasi (GST).Per confermare l'espressione delle proteine di fusione, il lisato delle cellule di insetto è stato analizzato tramite metodi standard di immuno blotting ( Sambrook and Russel, 2001). Successivamente, sono stati utilizzati anticorpi anti-GST coniugati a una perossidasi, per verificare la presenza degli antigeni a dimostranza della loro corretta adesione alla fase solida dell'ELISA. Preparazione degli antigeni virali per l'ELISA Per la produzione degli antigeni, le cellule High Five sono state infettate con un baculovirus ricombinante e fatte crescere in piastre per colture cellulari, utilizzando come terreno di coltura l'Ex-Cell 400. Dopo 72 ore di incubazione a 27°C, le cellule vengono staccate dalle piastre e risospese in PBS contenente EDTA , NP-40 ed un cocktail di inibitori di proteasi. Dopo una incubazione di 30' in ghiaccio, la sospensione cellulare viene sonicata per 2 volte in ghiaccio per 60''. Il lisato viene quindi centrifugato a 10000 giri per 15'; il sovranatante viene quindi raccolto e stoccato a -80°CGSTfusion protein ELISA Gli anticorpi verso le proteine del nucleocapside dei coronavirus vengono misurati con la tecnica ELISA, che utilizza come metodo di cattura il glutadione-S-tranferasi (GST) con alcune modificazioni ( Sehr et al, 2001). Il fondo dei 96 pozzetti di piastre PolySorb è stato sensibilizzato overnight a 4°C con glutadione-caseina in tampone carbonato a pH 9,6 e bloccato per 1 ora a 37°C con caseina e alcool polivinilico in PBS ( tampone- caseina PVA).Le piastre bloccate vengono incubate, quindi, per 1 ora a temperatura ambiente con le cellule di insetto lisate contenenti le proteine di fusione GST diluite con tampone-caseina PVA. La diluizione ottimale di ogni lisato viene eseguita con una serie di diluizioni seriali, prima di iniziare il test ELISA, utilizzando anticorpi verso la sequenza carbossiterminale del peptide antigenico del poliomavirus bovino (BPV), come anticorpo primario. Viene, quindi, controllato che i pozzetti siano coperti solo con il lisato di cellule di insetto che esprimono le proteine GST.Prima di aggiungere i sieri in esame e proseguire con la metodica, le piastre devono essere lavate 4 volte con PBS contenente Tween 20 per mezzo di un washer per piastre automatico.I sieri in esame, diluiti 1:100 con tampone-caseina, si mettono ad incubare per 1 ora a37°C.Il legame antigene-anticorpo è evidenziato per mezzo di una perossidasi coniugata ad anticorpi di capra, diretti contro le Immunoglobuline umane IgG e cateneGamma specifiche e diluiti 1:4000 in tampone-caseina PVA contenente polivinilpirrolidone e Tween 20. Dopo 30 minuti a 37°C, lo sviluppo del colore è dovuto all'aggiunta di una soluzione di perossido di idrogeno. La reazione viene bloccata dopo 20 minuti, con l'aggiunta di dodecil solfato , dopodiché viene misurata l'assorbanza a 405nm.L'assorbanza nei pozzetti contenenti solo GST è sottratta dall'assorbanza rilevata nei pozzetti dove sono presenti le proteine del nucleocapside legate al GST dei coronavirus, indicando, così,una reattività antigenica specifica.Dall'analisi dei risultati vorremmo valutare la diffusione di questi nuovi coronavirus in una popolazione di pazienti italiani immunocompromessiimmunocompromessi , se possibile valutare una corrispondenza con il quadro clinico e confrontare i risultati con la nostra precedente esperienza su pazienti pediatrici.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
