Le Cellule Staminali Tumorali (CSCs) rappresentano una sottopopolazione di cellule tumorali in grado di auto-rinnovarsi differenziandosi. Recenti evidenze suggeriscono che Stearoyl-CoA-desaturasi 1 (SCD1), enzima coinvolto nella sintesi degli acidi grassi monoinsaturi a partire dagli acidi grassi saturi, ha un ruolo in diverse neoplasie. Il gruppo di Ricerca studia da anni il ruolo di SCD1 nel tumore al polmone, il presente lavoro approfondisce gli aspetti legati alla sopravvivenza e alla propagazione delle CSCs confinando il sistema biologico all’adenocarcinoma polmonare. Nella prima parte della trattazione sono state utilizzate le linee primarie derivanti da versamento pleurico di adenocarcinoma del polmone, al fine di studiare gli effettori del pathway di Hippo, YAP e TAZ. In seguito all’inibizione di SCD1, le cellule 3D mostrano una riduzione di YAP/TAZ. La regolazione di YAP/TAZ da parte di SCD1 dipende anche dall'attività di β-catenina, poiché è stato dimostrato che la downregolazione di YAP/TAZ, indotta dal blocco di SCD1, può essere revertita con l'aggiunta del ligando esogeno. Affinché ci sia attivazione di SCD1 e di YAP/TAZ è necessario che il complesso di distruzione di β-catenina sia inattivo. In linea con i risultati in vitro, l'analisi immunoistochimica dei campioni di adenocarcinoma polmonare ha mostrato che i livelli di espressione di SCD1 co-variano con quelli di β-catenina e YAP/TAZ. I set di dati di espressione genica hanno permesso di osservare che gli elevati livelli di co-espressione di SCD1, β-catenina, YAP/TAZ e dei geni target hanno un forte valore prognostico negativo nell'adenocarcinoma polmonare. Infine, le analisi bioinformatiche, volte a identificare quali combinazioni geniche hanno avuto effetti sinergici sull'outcome clinico, hanno mostrato che una scarsa sopravvivenza è associata ad alta co-espressione di SCD1, β-catenina e YAP/TAZ e del gene target, birc5. Il recente lavoro pubblicato dimostra per la prima volta il coinvolgimento di SCD1 nella regolazione del pathway di Hippo nell’adenocarcinoma del polmone, e propone il metabolismo degli acidi grassi come regolatore chiave delle CSCs (Noto et al., 2017). Nella seconda parte del lavoro di Dottorato, lo studio approfondisce il meccanismo trascrizionale responsabile della regolazione di SCD1 nelle CSCs. Quindi, l’attenzione si è focalizzata sullo studio del promotore del gene SCD1. L’analisi bioinformatica è stata effettuata al fine di individuare i putativi siti di legame dei Fattori Trascrizionali implicati nella sua regolazione. I Fattori Trascrizionali identificati mediante analisi bioinformatica sono: Sterol-Regulated-Element-Binding-1 (SREPB-1), c-MYC, Fattore Nucleare Y (-YA e -YB) e il Fattore Nucleare kB (NF- kB). Sono state determinate le porzioni di arricchimento dei suddetti Fattori Trascrizionali mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-qPCR) nella regione di interesse del promotore. Dai risultati emerge che, il passaggio da cellule cresciute in condizioni di aderenza a sferoidi, presenta un importante arricchimento dei siti di legame dei Fattori Trascrizionali sul promotore di SCD1. Al fine di identificare i Fattori Trascrizionali che assumono importanza direttamente o indirettamente nelle CSCs, è stato effettuato il silenziamento genico per valutare se l’inibizione dell’attività possa esser riflessa sull’espressione di SCD1. Infatti, la regolazione di SCD1 in CSCs è influenzata dalla presenza di SREPB1 e NF-Y. Considerando i risultati ottenuti, l’obiettivo è stato quello di effettuare la mutagenesi sul promotore di SCD1, mediante il sistema CRISPR/Cas9 per ottenere dei cloni stabili che indicassero la porzione di promotore efficiente nella regolazione trascrizionale di SCD1 in CSCs. La generazione del clone PR_1Δ, in seguito a saggi funzionali, mostra una diminuzione dell’espressione di SCD1 e una ridotta capacità di formazione di cellule in 3D, poichè è stata deleta la porzione in cui sono presenti i siti di legame di SREBP1 e c-MYC e NF-kB. In futuro verranno approfondite le analisi di genomica funzionale del trascrittoma e di accessibilità della cromatina, sia circostanziate al promotore di SCD1 che ampliate nelle CSCs. Le informazioni che ne deriveranno ci permetteranno di rafforzare le informazioni e le terapie verso l’adenocarcinoma del polmone.

Studio della regolazione trascrizionale della Stearoyl-CoA Desaturase 1 (SCD1) in Cellule Staminali Tumorali di adenocarcinoma del polmone / DE VITIS, Claudia. - (2019 Feb 19).

Studio della regolazione trascrizionale della Stearoyl-CoA Desaturase 1 (SCD1) in Cellule Staminali Tumorali di adenocarcinoma del polmone

DE VITIS, CLAUDIA
19/02/2019

Abstract

Le Cellule Staminali Tumorali (CSCs) rappresentano una sottopopolazione di cellule tumorali in grado di auto-rinnovarsi differenziandosi. Recenti evidenze suggeriscono che Stearoyl-CoA-desaturasi 1 (SCD1), enzima coinvolto nella sintesi degli acidi grassi monoinsaturi a partire dagli acidi grassi saturi, ha un ruolo in diverse neoplasie. Il gruppo di Ricerca studia da anni il ruolo di SCD1 nel tumore al polmone, il presente lavoro approfondisce gli aspetti legati alla sopravvivenza e alla propagazione delle CSCs confinando il sistema biologico all’adenocarcinoma polmonare. Nella prima parte della trattazione sono state utilizzate le linee primarie derivanti da versamento pleurico di adenocarcinoma del polmone, al fine di studiare gli effettori del pathway di Hippo, YAP e TAZ. In seguito all’inibizione di SCD1, le cellule 3D mostrano una riduzione di YAP/TAZ. La regolazione di YAP/TAZ da parte di SCD1 dipende anche dall'attività di β-catenina, poiché è stato dimostrato che la downregolazione di YAP/TAZ, indotta dal blocco di SCD1, può essere revertita con l'aggiunta del ligando esogeno. Affinché ci sia attivazione di SCD1 e di YAP/TAZ è necessario che il complesso di distruzione di β-catenina sia inattivo. In linea con i risultati in vitro, l'analisi immunoistochimica dei campioni di adenocarcinoma polmonare ha mostrato che i livelli di espressione di SCD1 co-variano con quelli di β-catenina e YAP/TAZ. I set di dati di espressione genica hanno permesso di osservare che gli elevati livelli di co-espressione di SCD1, β-catenina, YAP/TAZ e dei geni target hanno un forte valore prognostico negativo nell'adenocarcinoma polmonare. Infine, le analisi bioinformatiche, volte a identificare quali combinazioni geniche hanno avuto effetti sinergici sull'outcome clinico, hanno mostrato che una scarsa sopravvivenza è associata ad alta co-espressione di SCD1, β-catenina e YAP/TAZ e del gene target, birc5. Il recente lavoro pubblicato dimostra per la prima volta il coinvolgimento di SCD1 nella regolazione del pathway di Hippo nell’adenocarcinoma del polmone, e propone il metabolismo degli acidi grassi come regolatore chiave delle CSCs (Noto et al., 2017). Nella seconda parte del lavoro di Dottorato, lo studio approfondisce il meccanismo trascrizionale responsabile della regolazione di SCD1 nelle CSCs. Quindi, l’attenzione si è focalizzata sullo studio del promotore del gene SCD1. L’analisi bioinformatica è stata effettuata al fine di individuare i putativi siti di legame dei Fattori Trascrizionali implicati nella sua regolazione. I Fattori Trascrizionali identificati mediante analisi bioinformatica sono: Sterol-Regulated-Element-Binding-1 (SREPB-1), c-MYC, Fattore Nucleare Y (-YA e -YB) e il Fattore Nucleare kB (NF- kB). Sono state determinate le porzioni di arricchimento dei suddetti Fattori Trascrizionali mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-qPCR) nella regione di interesse del promotore. Dai risultati emerge che, il passaggio da cellule cresciute in condizioni di aderenza a sferoidi, presenta un importante arricchimento dei siti di legame dei Fattori Trascrizionali sul promotore di SCD1. Al fine di identificare i Fattori Trascrizionali che assumono importanza direttamente o indirettamente nelle CSCs, è stato effettuato il silenziamento genico per valutare se l’inibizione dell’attività possa esser riflessa sull’espressione di SCD1. Infatti, la regolazione di SCD1 in CSCs è influenzata dalla presenza di SREPB1 e NF-Y. Considerando i risultati ottenuti, l’obiettivo è stato quello di effettuare la mutagenesi sul promotore di SCD1, mediante il sistema CRISPR/Cas9 per ottenere dei cloni stabili che indicassero la porzione di promotore efficiente nella regolazione trascrizionale di SCD1 in CSCs. La generazione del clone PR_1Δ, in seguito a saggi funzionali, mostra una diminuzione dell’espressione di SCD1 e una ridotta capacità di formazione di cellule in 3D, poichè è stata deleta la porzione in cui sono presenti i siti di legame di SREBP1 e c-MYC e NF-kB. In futuro verranno approfondite le analisi di genomica funzionale del trascrittoma e di accessibilità della cromatina, sia circostanziate al promotore di SCD1 che ampliate nelle CSCs. Le informazioni che ne deriveranno ci permetteranno di rafforzare le informazioni e le terapie verso l’adenocarcinoma del polmone.
19-feb-2019
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